中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

疫苗研究

  • 柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

    陈祥鹏;毛乃颖;张勇;谢正德;许文波;

    目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。

    2014年11期 v.27 1361-1368+1374页 [查看摘要][在线阅读][下载 659K]
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  • 食蟹猴肌肉注射冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的长期毒性

    苗丽;丁丽丽;李春艳;赵博;崔文广;苑志刚;刘岩;杨屹;

    目的评价食蟹猴反复肌肉注射冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的长期毒性。方法采用区段随机分组法,将24只食蟹猴分为阴性对照组、辅料对照组、冻干人用狂犬病疫苗低(1剂/次)、高(5剂/次)剂量组(分别为临床人用剂量的1和5倍),每组6只,雌雄各半,各组均于第0、3、7、14、28和42 d经肌肉注射各免疫1次,停药后进行一般临床观察及体重、体温、心电图、眼科、血液学指标、血液生化及电解质指标、尿液指标、免疫指标、骨髓涂片、脏器及组织病理学改变观察,连续观察4周。结果试验期间各组动物一般状况良好,注射部位肉眼观察无异常;体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血生化、眼科检查、尿常规、外周血T淋巴细胞亚群分布、血清细胞因子IL-2和IFNγ水平、骨髓组织、脏器系数等均未见有毒理学意义的规律性改变;疫苗低、高剂量组动物免疫后血清抗狂犬病病毒特异性抗体水平明显升高,均可产生具有保护作用(大于0.5 IU/ml)的中和抗体;辅料对照组和疫苗低、高剂量组部分动物注射局部可见轻微刺激性改变,4周恢复期结束时,局部刺激性反应消退。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)5剂/次(临床拟用剂量的5倍)以下为无毒性反应剂量,临床需重点关注注射部位局部刺激性反应。

    2014年11期 v.27 1369-1374页 [查看摘要][在线阅读][下载 379K]
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  • 国产水痘减毒活疫苗的稳定性观察

    马相虎;沈坚;陈哲文;王亮;沈谊清;晏子厚;

    目的观察国产水痘减毒活疫苗的稳定性。方法取40批上海生物制品研究所有限责任公司(以下简称上海公司)2007~2013年生产的水痘减毒活疫苗,按照国家食品药品监督管理局批准的水痘减毒活疫苗注册标准和《中国药典》的要求进行各项检定:在0月进行热稳定性试验;在0和18月进行鉴别试验、物理检查、水分检测、无菌检查、异常毒性检查、牛血清白蛋白残留量检测、抗生素残留量检测(2010年10月以后生产的疫苗);在0、6、12、18月进行病毒滴定。结果上海公司2007~2013年生产的水痘减毒活疫苗在有效期内各项指标检定结果均符合水痘减毒活疫苗注册标准和《中国药典》的相关要求。结论上海公司生产的水痘减毒活疫苗质量稳定,安全有效。

    2014年11期 v.27 1375-1377+1383页 [查看摘要][在线阅读][下载 268K]
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  • 冻干ACYW 135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

    李世慧;周第;韩俊杰;张永新;魏静;贾泽;孙芳芳;王珣;

    目的评价冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性。方法取3批冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗,分别置2~8℃及37℃存放,于不同时间点(37℃第1、2、3、4、12、24、48周;2~8℃第3、6、12、18、24、30、36个月)取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测4种多糖分子大小(KD值)及多糖回收率。另取3批疫苗,置2~8℃存放,分别于第12、18、24、30个月取样,进行疫苗全面检定;取同批疫苗进行酸(调p H值至5.0和4.0)、碱(调p H值至10.0和12.0)处理后置2~8℃,于不同时间点取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测多糖KD值及回收率。结果于2~8℃存放36个月、37℃存放24周的疫苗的多糖KD值及回收率,以及2~8℃存放30个月的疫苗的鉴别试验、外观、水分、多糖含量、分子大小及回收率、无菌检查、异常毒性检查、热源试验、细菌内毒素检查结果均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造和检定规程》(草案)要求。疫苗调p H值至5.0及10.0后置2~8℃存放48 h,多糖KD值及回收率均符合本企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造检定规程》(草案)要求。结论冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗于2~8℃存放30个月,性能稳定。

    2014年11期 v.27 1378-1383页 [查看摘要][在线阅读][下载 364K]
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  • 人二倍体细胞(2BS株)细胞库的建立及生物学特性鉴定

    梁本;王佳凤;侯良玉;麻广;李永忠;李立;哈秀杰;李开军;单玉杰;林崇健;刘晔;黄林;

    目的建立人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库。方法将人二倍体细胞(2BS株)扩大培养后冻存,建立主细胞库和工作细胞库,采用台盼蓝染色计数细胞,计算细胞活力,并进行染色体、外源病毒因子、微生物污染、致瘤性的检测及鉴别试验。将全面检定合格的工作细胞库细胞分别接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂,观察细胞形态;将水痘病毒分别按0.010 5、0.012 8、0.018 8 MOI接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂上的单层细胞,收获病毒原液,检测病毒滴度。结果主细胞库细胞活力为94.1%,工作细胞库细胞活力为94.4%;1 000个处于分裂相时期的细胞的核型分析结果均在《中国药典》三部(2010版)人二倍体细胞染色体分析标准的规定范围内;细胞上清液和裂解液中人外源病毒因子检测结果均为阴性,符合《中国药典》三部(2010版)规程要求;细胞均贴壁,成纤维细胞形态,种属鉴别为人细胞B型;细胞库未被细菌、真菌、病毒及支原体污染,也未出现致瘤性。建立的细胞库在3种培养器皿中均可在工艺要求时间内生长为单层,单位面积活细胞浓度在(2.01~2.59)×105个/cm2之间,收获的病毒滴度在5.0~5.25 lg PFU/ml之间,符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。结论建立了人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库,为2BS细胞应用于水痘减毒活疫苗的研发和生产提供细胞资源和理论依据。

    2014年11期 v.27 1384-1387页 [查看摘要][在线阅读][下载 385K]
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消息

  • 欢迎订阅《中国生物制品学杂志》

    <正>《中国生物制品学杂志》于1988年创刊,由中华人民共和国卫生部主管,系中华预防医学会系列杂志之一,为报道我国生物制品研究开发重大成果和最新进展的国内唯一生物制品专业学术期刊。主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域,如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。主要设有

    2014年11期 v.27 1387页 [查看摘要][在线阅读][下载 178K]
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基础研究

  • EV71两种结构形式的免疫学特性比较

    程晨;冯敏;杨二霞;普晶;崔萍芳;张莹;李建平;陈姝樾;王丽春;赵树栋;王晶晶;李剑兰;刘龙丁;李琦涵;

    目的分析肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在病毒增殖的动力学过程中不同时间点的病毒样品所具有的两种结构形式及免疫学特性,为疫苗的研发及质控提供参考。方法利用Opti Prep密度梯度离心获得EV71两种结构形式,电镜扫描观察两种结构形式的颗粒形态;采用病毒微量滴定法测定病毒两种结构形式的感染性滴度;EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)方法测定病毒两种结构形式的抗原含量;QRT-PCR法测定两种结构形式的病毒RNA含量;SDS-PAGE及Western blot鉴定病毒两种结构形式。将分离得到的空壳及实心病毒颗粒成分用甲醛灭活后,与Al(OH)3佐剂混合,对小鼠进行皮下多点注射,分别于初免28 d及二免7、14 d,经小鼠尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验法检测抗EV71中和抗体;将二免14 d后的雄、雌鼠合笼,生产后24 h内,用EV71FY-23对乳鼠进行颅内注射,10 d内观察乳鼠存活率。结果经Opti Prep密度梯度离心后,可获得两条沉降系数不同的病毒条带,位于上层的病毒结构成份基本以空心衣壳颗粒形式存在;下层病毒结构成分在感染前期主要为以实心颗粒形式存在,感染后期则以空壳和实心颗粒同时存在,两种结构形式均能被抗EV71特异血清识别。在病毒感染过程中,下层毒粒感染性滴度均比上层毒粒高2~3个log值;两种结构形式的抗原滴度均呈增加的趋势,但下层毒粒抗原滴度增加更为明显;病毒两种结构形式两层的RNA含量不同,下层毒粒中VP0均已裂解形成VP2和VP4,而上层毒粒中以VP0为主要成分。初免后28 d及二免后7、14 d,两种结构形式的EV71均诱导小鼠抗体阳转,但上层毒粒诱导的中和抗体效价及增长速度均明显低于下层毒粒(P均<0.001)。病毒两种结构形式免疫小鼠产生的乳鼠免疫保护效率均为100%。结论 EV71的两种结构形式虽然具有差异,但作为病毒疫苗抗原用于免疫时,均具有免疫学意义。

    2014年11期 v.27 1388-1393页 [查看摘要][在线阅读][下载 523K]
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消息

  • 征稿

    <正>《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域,如预

    2014年11期 v.27 1393页 [查看摘要][在线阅读][下载 122K]
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基础研究

  • 抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达

    陈刚;李计来;崔文禹;凌媛;徐静;张云涛;

    目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。

    2014年11期 v.27 1394-1399页 [查看摘要][在线阅读][下载 504K]
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  • 金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

    袁萍;王晓;吴根鹏;王月红;徐帆洪;朱为;

    目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。

    2014年11期 v.27 1400-1403+1411页 [查看摘要][在线阅读][下载 485K]
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  • 嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

    王馨莹;冯丽;许春春;于珊珊;

    目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。

    2014年11期 v.27 1404-1407页 [查看摘要][在线阅读][下载 461K]
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  • 不同细菌及酵母菌对阴道毛滴虫体外生长的影响

    丁鹤;于艳辉;宫鹏涛;李建华;杨举;李赫;张国才;张西臣;

    目的研究大肠埃希菌J20、保加利亚乳杆菌、金黄葡萄球菌及AH109酵母菌体外对阴道毛滴虫生长的影响。方法分别将不同浓度(104、105、106和107个/ml)的大肠埃希菌J20、保加利亚乳杆菌、金黄葡萄球菌及AH109酵母菌与阴道毛滴虫进行体外共培养,并对不同培养时间(2、4、6和8 h)的虫体进行计数。结果与空白对照组相比,大肠埃希菌J20及金黄葡萄球菌在低浓度(104个/ml)时即明显影响阴道毛滴虫体外生长(P均<0.01),在6 h时即可见白色死亡虫体沉淀:保加利亚乳杆菌仅在高浓度(106和107个/ml)时对阴道毛滴虫的生长有明显影响(P均<0.01):AH109酵母菌在不同浓度及不同培养时间对阴道毛滴虫的生长均无明显影响(P>0.05)。结论大肠埃希菌J20、金黄葡萄球菌及高浓度(106和107个/ml)保加利亚乳杆菌对阴道毛滴虫生长影响显著,而AH109酵母菌无明显影响,为进一步研究阴道毛滴虫感染后,在体内与阴道菌群的相互作用关系奠定了理论基础。

    2014年11期 v.27 1408-1411页 [查看摘要][在线阅读][下载 450K]
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  • 环磷酰胺暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤移植瘤中的表达

    王城;何文飞;张红梅;赵丹;杨金凤;廖君左;周柯均;

    目的探讨环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)移植瘤中的表达。方法建立免疫活性C57BL/6j系小鼠的人NB SK-N-SH细胞株荷瘤模型,选择瘤体积在100~200 mm3之间的20只荷瘤小鼠,随机分为生理盐水对照组(NS组)和环磷酰胺组(CP组),每组10只,CP组每日经腹腔注射CP75 mg/kg,2次/周,连续2周;NS组每日经腹腔注射NS 2 ml。每2天测量肿瘤体积,计算相对肿瘤体积(RTV);停药后次日处死小鼠,称瘤重,计算抑瘤率(IR);并采用RT-PCR法检测各组移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平,免疫组化法和Western blot法检测各组移植瘤组织中Piwil2蛋白的分布及表达水平。结果与NS组比较,CP组移植瘤的RTV和瘤重均显著降低(P<0.05),CP组的平均抑瘤率为83.56%。两组移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平差异无统计学意义(P>0.05)。NS组移植瘤组织中Piwil2蛋白高表达于胞浆,而CP组大部分肿瘤细胞坏死,Piwil2蛋白表达下降,细胞核稀疏,核浓缩,细胞体积变小;CP组移植瘤组织中Piwil2蛋白的表达水平明显低于NS组(P<0.05)。结论 CP干预后,移植瘤缩小,移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平不变,但蛋白表达水平有改变,可能影响人NB抵抗性。

    2014年11期 v.27 1412-1415页 [查看摘要][在线阅读][下载 459K]
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治疗性制剂

  • 黄芪多糖对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠的保护作用及肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1、白细胞介素-6表达的影响

    江龙;林时辉;高峰;徐昉;

    目的探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠的保护作用及血清和肺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor narcosis factor-α,TNF-α)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为对照组、ALI模型组和APS干预组,每组30只,ALI模型组和APS干预组均经腹腔注射LPS 5 mg/kg;对照组经腹腔注射生理盐水5 ml/kg。造模6 h后,APS干预组经尾静脉注射APS 20 mg/kg,对照组和ALI模型组给予等量生理盐水。分别于造模后0、6、12、24和48 h每组各取5只大鼠,计算肺组织湿重/干重比值(W/D),HE染色观察肺组织病理学形态,ELISA法检测血清中细胞因子TNF-α、ICAM-1和IL-6的水平;造模后24 h,每组各取5只大鼠,Western blot法检测肺组织中TNF-α、ICAM-1和IL-6蛋白的表达水平。结果造模后12、24和48 h,对照组W/D比值明显低于ALI模型组和APS干预组(P<0.01);APS干预组W/D比值在各时点均明显低于ALI模型组(P<0.01)。造模后12 h,与对照组比较,ALI模型组和APS干预组大鼠肺组织均出现较重度的炎性反应,但APS干预组较ALI模型组轻;造模后48 h,ALI模型组大鼠肺组织的炎性反应达高峰,而APS干预组逐渐消退。对照组大鼠血清TNF-α、ICAM-1和IL-6均维持在较低水平;ALI模型组和APS干预组大鼠血清TNF-α、ICAM-1和IL-6水平在造模后12 h开始明显升高,而APS干预组在12 h后各时点浓度均低于ALI模型组,且同一时点与ALI模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。造模后24 h,ALI模型组和APS干预组大鼠肺组织中TNF-α、ICAM-1、IL-6蛋白的表达水平均较对照组明显上升(P<0.01);而APS干预组与ALI模型组相比,明显下降(P<0.01)。结论 APS能有效减轻LPS所致的ALI,此作用与抑制TNF-α、ICAM-1和IL-6的过度表达,减轻炎症级联反应有关。

    2014年11期 v.27 1416-1420页 [查看摘要][在线阅读][下载 520K]
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诊断制剂

  • C群脑膜炎球菌家兔免疫血清的制备及其群特异性和相关方法专属性分析

    刘方蕾;吴兵;侯亚莉;杨英英;王晶;于旭博;范锋锋;孔素娟;袁菲;赵志强;谢贵林;

    目的制备C群脑膜炎球菌家兔免疫血清,并进行群特异性和相关方法专属性分析。方法用制备的C群脑膜炎球菌菌液免疫青紫兰家兔,经耳缘静脉注射8×109个/ml菌液,0.5~1.0 ml/只,每周1、3、5免疫,共免疫4周,于第6周开始加强免疫,每周2次,连续3周,于末次免疫1周后,经颈动脉采血,分离血清,采用免疫双扩散法检测血清效价。采用ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法分析其群特异性和相应方法专属性。结果建立了家兔免疫血清制备方法,制备的3份(1、2、3)免疫血清相应多糖抗体效价分别为1︰8、1︰8和1︰16。自制免疫血清1、3在使用工作浓度下,符合免疫学质量控制ELISA方法的特异性和专属性要求。自制免疫血清3可作为C群脑膜炎球菌结合物Western blot检测的Anti-PS血清,在该检测灵敏度下可完全达到与破伤风类毒素(TT)无交叉反应;血清1、2的轻微交叉反应可通过相应抗原预吸收血清消除,从而达到结合物Western blot检测的Anti-PS使用要求。自制3份免疫血清均可用于火箭免疫电泳分析。结论自制的家兔免疫血清可替代商品诊断血清,并达到了ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法群特异性和相应方法专属性要求,可用于对C群脑膜炎球菌结合物制备过程的多糖抗原性分析及结合疫苗质量控制。

    2014年11期 v.27 1421-1425+1432页 [查看摘要][在线阅读][下载 586K]
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  • 抗卵巢癌相关抗原CA125单抗及其磁酶诊断试剂的制备

    李雨桐;王甲男;韩顺子;于爱东;吴业红;张秀霞;

    目的制备卵巢癌相关抗原CA125(cancer antigen 125)磁酶检测试剂,并进行验证及初步应用。方法应用CA125抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合,筛选效价高、稳定性分泌抗体的杂交瘤细胞株后,接种小鼠腹腔,收集腹水,制备抗CA125单抗,并对其亚型、特异性、相对亲和力、抗原结合位点及抗原决定簇进行鉴定。通优化反应条件制备CA125抗原磁酶检测试剂,并进行验证后,将其应用于50份女性健康体检者及100份卵巢癌患者血清的检测。结果共获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4B6、2G10、1C2;1C2、4B6和2G10单抗的抗体亚型分别为Ig G2a、Ig G1和Ig G1,轻链均为κ链,相对亲和力依次为2G10>4B6>1C2,与AFP、CA50、CEA、CA199、CRP、CA242和小牛血清未发生交叉反应,1C2单抗识别位点与2G10和4B6不同,且3株单抗的抗原决定簇均在CA125蛋白部分上。确定该磁酶检测的反应条件为:包被抗体按100μg/ml,37℃包被1 h;20%小牛血清37℃封闭1 h或4℃封闭过夜;酶标抗体最佳反应时间为45 min。当CA125浓度在10~500 U/ml时,与对应的A450值线性关系良好,R2=0.992;该检测试剂最低检测极限约10 U/ml,灵敏度高;与人血清白蛋白、小牛血清、CA50、CEA、AFP、CRP、CA199和CA242均未发生反应,特异性高;于37℃放置4 d的CA125 A450值与2~8℃相比,差异无统计学意义(P<0.05);批内及批间变异系数均<10%,重复性较好;高、中、低3个浓度的CA125抗原的回收率在94.45%~105.21%之间,准确性高。50份健康体检者血清中CA125阳性率为4%,100份卵巢癌患者血清中CA125阳性率为88%。结论已成功制备了卵巢癌相关抗原CA125磁酶检测试剂,该试剂具有应用于卵巢癌患者的诊断价值。

    2014年11期 v.27 1426-1432页 [查看摘要][在线阅读][下载 572K]
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临床研究

  • 不同年龄、不同献血浆次数的献血浆者血浆蛋白含量的监测

    王小兵;陈开宇;

    目的通过对不同年龄、不同献血浆次数的献血浆者血浆蛋白含量变化的监测,观察献血浆者对血浆蛋白含量的影响。方法选取1 078名献血浆者,按不同年龄(18~35、36~45及46~55周岁)、不同献血浆次数(1~26、27~52、53~78及79~100次)分组,采用双缩脲法检测血浆蛋白含量。结果献血浆者不同年龄及不同献血浆次数实验组间血浆蛋白含量经F检验,差异均无统计学意义(P>0.05),所有献血浆者血浆蛋白含量均在50 g/L以上。结论不同年龄、不同献血浆次数对血浆蛋白含量无明显影响。

    2014年11期 v.27 1433-1434页 [查看摘要][在线阅读][下载 374K]
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消息

  • 欢迎登录《中国生物制品学杂志》网站

    <正>尊敬的专家、读者、作者及各位同仁:您们好!自2007年8月起,《中国生物制品学杂志》网站(www.zgswj.com.cn,中文域名:中国生物制品学杂志.com)正式运行。本站网页有杂志简介、在线投稿、稿件查询、过期目录、广告合作等您所需要的信息,欢迎登录。

    2014年11期 v.27 1434页 [查看摘要][在线阅读][下载 275K]
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技术方法

  • A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟菌血清抗体特异性体外杀菌试验方法的建立及其验证

    乔瑞洁;赵志强;王浩;王欣茹;刘佳;刘方蕾;吴兵;于旭博;林纪胜;李亚南;叶强;谢贵林;

    目的建立A、C、W135和Y群脑膜炎奈瑟菌血清抗体特异性体外杀菌试验方法 (serum bactericidal assay,SBA),并进行验证。方法对SBA中活菌收获时间、靶菌的制备、反应时间及补体进行优化,并确定质控血清Men10的质控范围。对优化后的方法进行特异性、线性、精密度验证。结果确定A600值为0.5~0.8时为收获细菌最佳收获时间;冻存菌种可替代新鲜制备菌种作为靶菌;最佳杀菌反应时间为60 min;17830和84321N批补体均可用于试验。质控血清Men10的质控范围A群为521~4 689,C群为1 047~9 423,W135群为1 779~16 008,Y群为1 416~12 741。A、C、W135和Y同群多糖吸收血清样品后能够抑制≥80%的同群SBA滴度,而异群多糖则<20%;血清样品稀释倍数与对应的SBA滴度呈显著负相关,斜率在-0.90~-1.10之间,Pearson相关系数在0.90~1.0之间,P均<0.001;同一实验内相同样品检测结果 CV≤25%,实验间相同样品的95%的检测结果落在检测值中位数3倍(一个稀释度)的范围内,CV≤40%,不同实验室间相同样品的检测结果至少有70%落在美国CDC公布结果的3倍(一个稀释度)范围内。结论建立了标准化的具国际间可比性的A、C、W135和Y群脑膜炎奈瑟菌SBA,该方法特异性、线性和精密度良好。

    2014年11期 v.27 1435-1442页 [查看摘要][在线阅读][下载 672K]
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消息

  • 2015中国(南京)国际生物医药产业博览会

    <正>随着Biotech China在境内外宣传力度的不断加大,引起了国内外生物医药行业组织的广泛关注,先后有美国、加拿大、瑞士、德国、澳大利亚、芬兰、苏格兰、以色列、印度、韩国及中国台湾等国家和地区组团参展,展会国际化程度进一步提升。2015中国(南京)国际生物医药产业博览会将于2015年9月

    2014年11期 v.27 1442页 [查看摘要][在线阅读][下载 76K]
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技术方法

  • TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

    刘宇;王潇潇;宋冬梅;温智恒;鲁卫卫;陈蕾;李秀玲;

    目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。

    2014年11期 v.27 1443-1447页 [查看摘要][在线阅读][下载 515K]
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  • 人血清中A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖IgG抗体含量ELISA检测方法的建立

    王欣茹;赵志强;李亚南;刘方蕾;于旭博;孔素娟;范锋锋;林纪胜;叶强;谢贵林;

    目的建立人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖Ig G抗体含量的ELISA定量检测方法,并进行验证。方法筛选适用的酶标板,优化抗原包被浓度,确定ELISA检测过程的关键条件,对建立的ELISA方法的特异性、线性、准确性、精密度、最低检测值和稳定性进行验证,并建立实验室质控血清的质控检测范围。结果酶标板的板内CV为9.8%,板间CV为16.4%,符合检测使用要求。免疫血清经多糖吸收后,群特异性抗体含量与同群多糖吸收剂量呈明显的剂量依赖关系。12份美国CDC质控血清中各群Ig G抗体含量与血清的稀释度呈负相关,相关系数(r)和斜率(slope)均接近-1,线性关系良好;检测结果与CDC公布数据一致性良好,一致性相关系数A、C、W135、Y群分别为0.912 5、0.939 6、0.963 7和0.920 6,准确度较好。实验室内部质控血清Men20中各群Ig G抗体含量试验内和试验间精密度分别小于10%和20%,精密度较好;各血清群别的CV值均<30%,稳定性较好;A、C、Y、W135群多糖Ig G抗体含量最低检测值分别为0.092、0.118、0.067和0.035μg/ml,质控血清的检测范围分别为:92.49~36.53、37.29~17.69、66.18~25.54和50.15~23.31μg/ml。结论建立了标准化的检测人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖Ig G抗体含量的定量ELISA方法,并确定了实验室日常用质控血清Men20的质控检测值范围。

    2014年11期 v.27 1448-1453页 [查看摘要][在线阅读][下载 553K]
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  • 流感病毒裂解工艺的优化

    张赐强;姚为民;刘旭光;孙悦征;赵丹红;曾亮;刘燕;顾建阳;李晓波;郭占龙;杨旭;王亚军;

    目的探讨影响流感病毒裂解的因素,优化流感病毒裂解工艺。方法分别在不同裂解时间(Triton X-100裂解1、2、3和4 h)、不同终浓度的裂解剂(终浓度为0.5%、0.6%、0.7%和0.8%的Triton X-100)、不同总蛋白浓度(2 000、3 000和4 000μg/ml)及不同的离子强度[终浓度为0.01、0.05、0.1和0.5 mol/L的PBS(p H 7.2)]下,对流感病毒进行裂解,电镜下观察病毒裂解效果,同时采用免疫单扩散法检测血凝素含量,Lowry法检测总蛋白含量,计算蛋白含量/血凝素含量比值(裂解后病毒纯度)及血凝素回收率,确定最佳裂解工艺参数。结果当裂解前病毒纯化液蛋白含量范围为2 000~3 000μg/ml,PBS终浓度为0.1 mol/L时,利用终浓度为0.7%~0.8%的Triton X-100裂解流感病毒2 h,可获得最佳裂解效果。结论确定了流感病毒最佳裂解参数,优化了流感病毒裂解疫苗生产中的裂解工艺。

    2014年11期 v.27 1454-1458+1462页 [查看摘要][在线阅读][下载 694K]
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  • 两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2BS细胞的敏感性

    梁慧颖;隋波;赫宝双;梁雪;李生军;张宇;杨晓叶;沈红杰;

    目的用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)(Oka株)毒种,比较两种方法制备的毒种对2BS细胞的感染复数及増殖动态差异。方法用现有方法(用含2%小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种)和新方法(用含90%小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种)制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1)感染第37代2BS细胞,观察细胞病变(CPE)情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2BS细胞感染的最适MOI。结果现有方法制备毒种以0.01~0.1 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001~0.01 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期。两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4~4.6 lg PFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8~4.0 lg PFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准。结论现有方法和新方法制备的毒种最适MOI分别为0.01~0.1和0.001~0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产。

    2014年11期 v.27 1459-1462页 [查看摘要][在线阅读][下载 624K]
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  • 腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证

    孟凡红;刘先超;王爽;李晶;沙雪艳;黄金凤;尹卫东;

    目的建立腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法,并进行验证。方法针对腮腺炎减毒活疫苗株S79血凝素(hemagglutinin,H)基因保守区域设计特异性引物和Taq Man荧光探针;以05008批腮腺炎减毒活疫苗S79株成品作为参考品,将参考品或供试品稀释后,接种于长成单层的Vero细胞中,采用低渗合并冻融法将细胞破碎,吸取上清,进行荧光定量RT-PCR。优化病毒感染时间,并对该方法的特异性、精密性及准确性进行验证。结果病毒感染的最佳时间为18 h;建立的荧光定量RT-PCR法只对腮腺炎减毒活疫苗具有特异性扩增,对灭活的腮腺炎减毒活疫苗、水痘病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、风疹病毒和Vero细胞均无扩增曲线出现;该方法检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品6组数据的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<5%,不同操作人员于不同日期检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品的标准曲线回归方程R2均大于0.97,RSD均<5%;该方法与细胞病变法测得的11批腮腺炎减毒活疫苗成品的病毒滴度值之差均≤0.2 Lg CCID50/ml,两组数据差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的荧光定量PCR法检测腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度特异性较强,精密性和准确性良好,且快速方便,可应用于企业生产过程中的内部质控。

    2014年11期 v.27 1463-1467+1472页 [查看摘要][在线阅读][下载 591K]
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  • 牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法的建立及验证

    袁良玉;黄敏;潘海龙;吕冰凌;王静;谭昌耀;朱文;

    目的建立牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法建立直接免疫荧光法检测牛血清中牛病毒,对细胞接种浓度和血清浓度、病毒接种量、荧光抗体浓度、染色温度及时间进行优化;对优化的方法进行重复性、特异性、灵敏度验证,并与细胞培养法的检测结果进行比较。结果优化的试验条件为:Vero和BT细胞的接种浓度分别为0.5×105和1.0×105个/ml,血清浓度为5%,病毒接种量为100~300 CCID50,荧光抗体1∶10稀释,4℃染色12 h以上,但不超过24 h。2名实验人员按建立的方对3批牛血清分别进行3次检测,均未检出6种牛病毒;每种病毒仅在相应抗体进行染色时出现荧光;该方法检测6种牛病毒的灵敏度较高。分别采用细胞培养法和直接免疫荧光法检测15批新生牛血清和5批胎牛血清,结果均未检出牛病毒。结论建立的牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法重复性好,特异性强,灵敏度高,操作简便,与细胞培养法的检测结果无差异,可应用于牛血清中牛病毒的检测。

    2014年11期 v.27 1468-1472页 [查看摘要][在线阅读][下载 558K]
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  • C群流行性脑膜炎球菌多糖分批发酵动力学模型的建立

    夏永;王斌;王公孝;李应伟;王智杰;王学林;许蓉华;邓雪莲;熊慧玲;

    目的建立C群流行性脑膜炎球菌多糖50 L罐分批发酵动力学模型,为实现对C群流行性脑膜炎球菌多糖发酵过程的工艺控制、优化及其放大提供理论依据。方法利用分批发酵的数据,以Logistic方程建立菌体生长动力学模型,以Leudedeking-Piret微分方程建立产物合成动力学模型,以底物消耗的物料平衡方程建立底物消耗的动力学模型,并应用Origin软件进行模型拟合,获得3个模型的参数。结果菌体的最大比生长速率(μmax)为0.731 2 h-1,最大菌体浓度(Xmax)为3.949 5 g/L,与菌体生长速率关联的产物合成常数(a)为0.004 97 g/(L·h),与菌体浓度关联的产物合成浓度(β)为0.015 44 g/(L·h),菌体对底物的得率(Yx)为1.905 2 g/g,产物对底物的得率(Yp)为0.130 1 g/g,菌体的维持因子(m)为1.070 1。结论建立的动力学模型能较好地反映C群流行性脑膜炎球菌多糖分批发酵过程中菌体生长、C群多糖合成和基质消耗的的变化规律。

    2014年11期 v.27 1473-1476页 [查看摘要][在线阅读][下载 560K]
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  • 直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度条件的优化及验证

    王梦舒;郑宇;郭丽姝;陶雷;程晓耕;徐菲;

    目的对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证。方法考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒滴度的影响;对优化的方法进行试验间精密性和特异性验证,并与小鼠脑内滴定法的检测结果进行比较。结果选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;34℃作为病毒培养温度;病毒培养至96 h时进行染色,判定实验结果;病毒培养至第3天时进行荧光灶计数,计算病毒液中病毒的数量。两名操作人员12次检测结果的变异系数仅为0.05%;用该方法检测不同病毒,仅狂犬病病毒组出现特异性荧光,而犬瘟热病毒和犬细小病毒组未观察到荧光灶。采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测狂犬病病毒样品的病毒滴度结果差异无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性。结论优化的直接免疫荧光法精密性良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于狂犬病病毒滴度的定量检测。

    2014年11期 v.27 1477-1480页 [查看摘要][在线阅读][下载 467K]
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  • 纳豆激酶高产菌株发酵条件的优化

    蔡玉华;胥振国;

    目的以纳豆芽孢杆菌为出发菌株,对其产纳豆激酶(nattokinase,NK)的发酵条件进行优化。方法采用单因素试验,研究发酵过程中培养方式(振荡和静止培养)、接种量(0、2、4、6、8和10 ml)、培养温度(18、25、30、37、45℃)、培养时间(12、24、36、48、60、72 h)、初始p H(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)5个因素对NK酶活力的影响,选择主要影响因素进行正交试验以期得到最佳组合。结果最佳优化条件为:振荡培养(200 r/min),接种量6%,培养温度37℃,培养时间48 h,初始p H值6.5。在该条件下,NK酶活性可达751 U/ml。结论已对纳豆激酶高产菌株发酵条件进行了优化,为提高纳豆激酶产量,降低生产成本创造了条件。

    2014年11期 v.27 1481-1484页 [查看摘要][在线阅读][下载 499K]
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  • 带状疱疹疫苗生产中2BS细胞细胞工厂培养工艺的建立

    梁雪;刘延威;张宇;石磊;杨晓叶;李生军;沈红杰;

    目的建立带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺。方法将2BS细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行细胞计数。取细胞工厂,按MOI 0.008接种水痘-带状疱疹病毒,制备成带状疱疹减毒活疫苗,检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验;采用酶联免疫法检测抗生素残留量和牛血清白蛋白残留量;凝胶法检测内毒素含量;水分容量滴定法检测水分含量。结果 2BS细胞按1∶2比例传代,细胞工厂单层加液量为300 ml,可制备单层致密、优质的细胞,细胞工厂收获时细胞病变达80%以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,且1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃稳定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6 lg PFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求。结论建立了带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺,利用细胞工厂可制备出质量均一、致密优质的2BS细胞。

    2014年11期 v.27 1485-1487+1492页 [查看摘要][在线阅读][下载 605K]
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综述

  • 记忆性T细胞亚类的研究进展

    史利军;袁维峰;王净;李刚;

    T细胞免疫对于调节抗体的生成及清除受感染的细胞均发挥相当重要的作用。记忆性T细胞的特点是在初次免疫反应完成后仍能长期存活,并形成不同的亚类,每一亚类细胞又分为中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞。这些记忆性T细胞在宿主体内长期存在,当宿主受到再次感染时可提供有效的保护作用。本文结合最新研究进展,对主要的记忆性T细胞(如CD8+和CD4+记忆性细胞)类型及其功能作一综述。

    2014年11期 v.27 1488-1492页 [查看摘要][在线阅读][下载 461K]
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  • 木聚糖酶热稳定性分子改造的研究进展

    李同彪;周晨妍;王丹丹;

    木聚糖酶广泛应用于食品加工、生物制药、酒的澄清及纸浆漂白等行业。热稳定性对于木聚糖酶在工业领域中的应用起着至关重要的作用。根据催化结构域的氨基酸组成不同,木聚糖酶主要分为F/10和G/11两大家族。本文主要就这两大家族木聚糖酶热稳定性分子改造的技术和方法作一综述,为进一步提高木聚糖酶的热稳定性提供参考。

    2014年11期 v.27 1493-1496页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K]
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