中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

消息

  • 消息

    <正>来自ATCC的基因靶向工具ATCC发布三个新的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养细胞系,用于支持未分化胚胎干细胞系和iPS细胞系的生长。DR4 MEF(ATCCSCRC-1045TM)带有抗生素耐药基因,可以耐受新霉素(G418)、嘌呤霉素、潮霉素和6-硫基鸟嘌呤。SNL76/7(SCRC-1049TM)是一个克隆,来自于具有G418抗性和

    2012年05期 v.25 556+561+583+588+596+642+656页 [查看摘要][在线阅读][下载 269K]
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疫苗研究

  • 风疹病毒松叶株全基因序列测定与分析

    刘晨鸣;冯德杰;赵雅静;魏然;魏至栋;高雪军;朱莉萍;

    目的对我国现用风疹病毒(Rubella virus,RV)疫苗生产毒株松叶株(Matsuba)进行全基因组测序,分析其在减毒过程中的遗传与变异特点,为其安全性评价及遗传学质量控制的标准化提供依据。方法利用RT-PCR法分段扩增我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全序列,分别将产物插入到T-A克隆载体pGEM-T easy中,构建病毒cDNA文库,进行全基因组序列测定与分析。结果我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全长9 762 nt,含2个ORF,分别位于核苷酸41~6388位和6512~9700位,编码2 116、1 062个氨基酸;与GenBank中登录的Matsuba.GMK3野毒株和Matsuba疫苗株核苷酸同源性分别为97.5%和99.9%,氨基酸同源性分别为98.8%和99.9%;其在减毒的过程中共有37个氨基酸位点发生变异,其中非结构蛋白P150有18个氨基酸位点发生突变,结构蛋白E1和E2主要抗原位点氨基酸未发生变异,E1-177位糖基化位点突变丢失。结论我国现用风疹病毒Matsuba疫苗株与同类减毒株具有较高的同源性,其主要的抗原位点在减毒保种过程中高度保守,为在分子水平上保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据。

    2012年05期 v.25 525-528页 [查看摘要][在线阅读][下载 196K]
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  • β-丙内酯对甲型肝炎病毒的灭活效应

    蒋建江;戚凤春;胡艳灵;潘翔;陈统球;

    目的观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应。方法采用1∶4 000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验。通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定最佳灭活时间;检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应。结果β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3 d后,检测不出病毒;β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12 d效果更好;两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640 EU/0.1 ml;免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100%,且对小鼠及豚鼠均无毒性。结论β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性。

    2012年05期 v.25 529-530页 [查看摘要][在线阅读][下载 106K]
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基础研究

  • 丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性

    刘霜;鞠鹤鹏;戚中田;边中启;秦照玲;

    目的构建组氨酸(Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性。方法利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果 H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确;体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90%以上;野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低。

    2012年05期 v.25 531-535页 [查看摘要][在线阅读][下载 376K]
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  • 狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

    李业伟;杨洋;刘晔;王景龙;孙程龙;韩乃君;刘祥义;扈荣良;

    目的构建狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定。方法将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度。结果酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确;电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构;PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带;Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带;经测定,重组病毒的滴度为106.25TCID50/ml,较Bartha-K61亲本株的滴度(107TCID50/ml)下降。结论成功构建了RV SRV9株糖蛋白基因重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础。

    2012年05期 v.25 536-538+548页 [查看摘要][在线阅读][下载 331K]
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  • 狂犬病病毒SRV9株糖蛋白333位氨基酸变异对其免疫原性的影响

    孙程龙;杨洋;王颖;宫婷;刘祥义;陈奇;王景龙;刘晔;张守峰;扈荣良;

    目的探讨狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响。方法采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异。结果 SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确;制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变;RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达;rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S(P<0.05)。结论 RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性。

    2012年05期 v.25 539-544页 [查看摘要][在线阅读][下载 454K]
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  • 埃可病毒6型分离株KM57-09VP1基因的遗传特征

    陈俊英;王湘宜;潘玥;叶君;张名;孙强明;马绍辉;

    目的分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6)KM57-09分离株VP1基因的遗传特征。方法采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序;采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接;采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较。结果分离株为E6,其VP1区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp;KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6%~96.0%之间,氨基酸同源性在95.2%~99.0%之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性最高,分别为96.0%和99.0%,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7%~80.9%和95.8%~97.2%;基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝。结论 KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝。

    2012年05期 v.25 545-548页 [查看摘要][在线阅读][下载 249K]
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  • 乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

    张琴;彭俊;沈薇;

    目的构建乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒,并筛选能有效抑制HBx表达的干扰序列。方法设计并构建针对HBx基因的3个siRNA表达质粒,经酶切和DNA测序鉴定,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA的转录水平,Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达水平。结果酶切和测序鉴定质粒构建正确,插入片段的碱基序列符合实验设计;质粒转染HepG2.2.15细胞后,HBx基因的转录水平、相对表达量及HBx蛋白的表达水平均明显降低(P均<0.01),3个重组质粒均能抑制HBx蛋白的表达,且质粒shRNA-HBx3抑制能力最强。结论已成功构建了靶向HBx基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出具有高效沉默HBx基因的shRNA质粒,为进一步研究HBx感染合并肝细胞脂肪变性的发生发展奠定了基础。

    2012年05期 v.25 549-552页 [查看摘要][在线阅读][下载 369K]
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  • 含Coiled-coil结构的PML结构域与CNPY2蛋白相互作用的胞内外验证

    吴秀娟;刘北忠;鈡梁;初晨;朱丹;吴燕;

    目的通过胞内外试验验证含Coiled-coil结构的PML结构域(PML-C)与CNPY2蛋白的相互作用。方法将质粒pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C共转化入酵母菌AH109,通过酵母双杂交技术检测CNPY2蛋白和PML-C在AH109细胞内的相互作用;构建重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2,共转染HEK293细胞,采用Western blot法检测细胞中CNPY2蛋白的表达;免疫共沉淀技术从胞外验证两种蛋白的相互作用。结果 pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C质粒共转化入AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2共转染的HEK293细胞的全细胞裂解液可与鼠抗c-MYC单抗特异性结合;经免疫共沉淀可检测到与PML-C相互作用的蛋白复合体。结论通过酵母双杂交试验和免疫共沉淀技术证实,PML-C与CNPY2蛋白存在相互作用。

    2012年05期 v.25 553-556页 [查看摘要][在线阅读][下载 280K]
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  • 重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白的表达、纯化及其活性

    王伟;王伟华;崔杰;杨静华;颜真;

    目的表表达并纯化重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白,并鉴定其生物学活性。方法将重组质粒pRSET-dsCARE转化大肠杆菌BL21(DE3),分别于37、28℃表达目的蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Western blot、HPLC鉴定目的蛋白,MTT法检测dsCARE对转染poly(I∶C)细胞的增殖抑制作用。结果dsCARE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中呈组成性稳定表达,平均每升培养基可收获湿菌体约10 g;纯化产物的SDS-PAGE纯度达95.8%;纯化的目的蛋白能与抗-His多抗发生特异性反应;HPLC纯度达95.1%;每10 g湿菌体可纯化dsCARE重组蛋白约7.5 mg,浓度约220μg/ml;纯化的dsCARE重组蛋白与转染poly(I∶C)的HeLa细胞共同孵育,可剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖活性。结论成功建立了重组dsCARE蛋白的表达、纯化工艺及活性鉴定方法,为其应用和后续研究奠定了基础。

    2012年05期 v.25 557-561页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K]
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  • 羊痒病病毒株对鼠神经瘤细胞的影响

    张晓晶;李忠义;万家余;鞠传静;梁斌斌;刘文森;刘林娜;孙玉成;刘晋平;钱军;

    目的研究羊痒病病毒株(22L)对神经瘤细胞(N2a)的影响,并建立研究朊病毒病的细胞模型。方法用感染22L的鼠脑匀浆感染正常的N2a细胞,经荧光倒置显微镜、电镜及HE染色对正常细胞和染毒细胞(N2a-22L)的形态和内部结构进行观察,并通过Western blot检测细胞中朊病毒(Prions,PrPS)c的含量。结果镜下观察可见,N2a-22L细胞的神经突起较N2a细胞明显增多,并交织成复杂的网状结构;线粒体出现明显的空化,嵴消失;细胞体积减小,细胞核皱缩,细胞间通过突起连在一起,细胞核与细胞质界限模糊。N2a-22L细胞蛋白PrP经PK酶消化后,可见抗PK酶的PrPSc,N2a细胞的PrP蛋白均能被PK酶消化,表明N2a-22L已稳定感染了22L。结论 N2a-22L细胞可作为研究朊病毒病的细胞模型,为研究朊病毒病发病机制提供了有效途径。

    2012年05期 v.25 562-564页 [查看摘要][在线阅读][下载 257K]
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  • 肺内上皮-间质转化机制在小鼠支气管肺发育不良中的作用

    刘芳君;邓春;郭春宝;符州;

    目的观察肺表面活性物质蛋白B(Surfactant protein B,SP-B)及成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast-specificprotein 1,FSP1)在支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型小鼠中的表达情况,探讨肺内上皮-间质转化(Ep-ithelial-mesenchymal transformation,EMT)在BPD中的作用及机制。方法建立BPD小鼠模型;免疫组化法观察各组小鼠肺组织病理学改变;Masson染色法观察各组小鼠肺组织胶原含量;免疫荧光双标法对EMT进行动态监测;荧光定量PCR法检测SP-B和FSP1基因mRNA的表达水平;体积描述法检测小鼠肺功能改变。结果与对照组比较,BPD组中浓度氧暴露后,小鼠肺组织逐渐出现肺泡化发育障碍、间隔增厚、胶原沉积明显;给氧14、21 d时,BPD组小鼠肺组织出现SP-B和FSP1共表达,而对照组未见共表达;与对照组比较,给氧21 d时SP-B基因mRNA表达水平明显下降,FSP1明显升高(P均<0.05);与对照组比较,BPD组呼吸频率(F)及潮气量(TV)均明显降低(P<0.05)。结论通过EMT机制生成的成纤维细胞是BPD中肺纤维化的重要来源。

    2012年05期 v.25 565-569页 [查看摘要][在线阅读][下载 523K]
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  • 人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体的原核表达及纯化

    杨浩;姚海燕;陈圆圆;阎波;郭鹏;马驰;韩跃武;

    目的克隆人源抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法利用生物信息学手段,对人源抗菌肽LL-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白。结果改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高;重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为11 000,主要以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白纯度可达95%,浓度为0.473 mg/ml。结论已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础。

    2012年05期 v.25 570-573页 [查看摘要][在线阅读][下载 305K]
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  • 发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响

    戴凌燕;李志江;王欣;李娟;关琛;李良玉;周世珠;

    目的探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响。方法建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂量的发酵糙米提取物[100和300 mg/(kg.d)],观察对高血脂大鼠总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、动脉硬化指数(Atherosclerotic index,AI)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等生化指标的影响。结果发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDL浓度;增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度。结论发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果。

    2012年05期 v.25 574-578页 [查看摘要][在线阅读][下载 218K]
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  • Runx3-shRNA表达载体的构建及其干扰作用的检测

    郭元红;陈伟庆;房殿亮;

    目的构建Runx3基因shRNA重组表达质粒,并检测其干扰作用。方法人工合成靶向Runx3基因的shRNA序列,克隆至pGenesil-1.1表达载体上,构建重组表达质粒Runx3-shRNA,转染人耐药肝癌HepG2细胞;采用半定量RT-PCR及Western blot法检测重组表达质粒对HepG2细胞中Runx3基因的转录和表达水平的影响。结果重组表达质粒Runx3-shRNA经酶切及测序证明构建正确;其转染人耐药肝癌HepG2细胞后,细胞Runx3基因的转录和蛋白表达水平均明显降低,与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论已成功构建了Runx3-shRNA表达质粒,为进一步研究Runx3基因在肿瘤耐药细胞中的作用奠定了基础。

    2012年05期 v.25 579-583页 [查看摘要][在线阅读][下载 486K]
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  • 辛酸钠对人免疫球蛋白中病毒的灭活效果

    邹莉;邹炜;彭良俊;李策生;邢延涛;段凯;彭焱;吴凡;方舸;

    目的研究辛酸钠对人免疫球蛋白中脂质包膜病毒和非脂质包膜病毒的灭活效果。方法人免疫球蛋白样品中加入≥6 LgTCID50/0.1 ml的脂质包膜病毒伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯病毒、HIV-1111B株或非脂质包膜病毒猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV),于(30±1)℃水浴条件下作用不同时间后,测定残余病毒滴度,并经传代培养验证辛酸钠灭活病毒的效果。检测灭活处理后人免疫球蛋白的理化及生物学特性,并经SDS-PAGE和双向电泳法分析灭活处理后蛋白的结构。结果辛酸钠能有效灭活人免疫球蛋白中的脂质包膜病毒,目的蛋白的回收率达97%以上,而对无包膜病毒的灭活作用不明显;辛酸钠处理未影响人免疫球蛋白的理化和生物学特性及蛋白的结构。结论辛酸钠对脂质包膜病毒具有较好的灭活效果,可确保人免疫球蛋白生产工艺的安全性。

    2012年05期 v.25 584-588页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K]
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  • hDNMT1基因抑制对胆管癌细胞中p16和RASSF1A基因甲基化的影响

    李修红;罗放;向吉锋;王济明;

    目的运用siRNA抑制肝门部胆管癌QBC939细胞系中人DNA甲基转移酶1(Human DNA methylation trans-ferase 1,hDNMT1)基因的表达,探讨hDNMT1基因沉默后对QBC939细胞抑癌基因p16和RASSF1A去甲基化的影响,初步阐明其机制。方法根据GenBank中登录的hDNMT1 mRNA的核苷酸序列设计并合成发夹式siRNA序列,并以此为模板构建siRNA质粒,经脂质体转染QBC939细胞,通过RT-PCR检测hDNMT1、p16、RASSF1A基因mRNA转录水平;甲基特异性PCR(MSP)检测p16、RASSF1A基因的甲基化情况;MTT法检测QBC939细胞增殖活力。结果 sihDNMT1可有效抑制QBC939细胞中hDNMT1基因mRNA转录水平,同时上调p16、RASSF1A抑癌基因mRNA转录水平;sihDNMT1可促进p16、RASSF1A抑癌基因的去甲基化,并抑制QBC939细胞增殖,增殖抑制率在转染后72 h达到峰值。结论 hDNMT基因引起的抑癌基因启动子区异常甲基化是促进肝门部胆管癌发生发展的一个重要因素,抑制hDNMT1基因的表达可促进抑癌基因的去甲基化,为肝门部胆管癌的基因治疗提供了新的思路。

    2012年05期 v.25 589-592页 [查看摘要][在线阅读][下载 321K]
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治疗性制剂

  • 促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A对肿瘤细胞的靶向性作用

    李星;田园;张国利;吴广谋;朱平;岳玉环;

    目的探讨重组促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A(Luteinizing hormone releasing hormone-pseudomonasexotoxin A,LHRH-PE40)与肿瘤细胞和正常细胞膜表面受体特异性结合的差异。方法常规培养Hep-2、A549及LO2细胞,通过细胞毒性试验观察LHRH-PE40对3种细胞的形态学影响及生长抑制作用;通过LHRH-PE40与LHRH受体的结合试验及LHRH对LHRH-PE40竞争性抑制试验,测定LHRH-PE40在不同细胞中膜表面受体结合的差异。结果 LHRH-PE40对Hep-2、A549细胞具有明显的杀伤作用,细胞收缩变圆,色暗,折光性差,裂解死亡,杀伤作用随LHRH-PE40浓度的增大而增强,IC50值分别为0.45和0.19μmol/L,而对LO2细胞毒性作用较弱;LHRH-PE40可与Hep-2和A549细胞受体结合密切,A490值较高,与两种细胞的结合力随着时间的延长而增加,与LO2细胞结合较弱;LHRH可以竞争性拮抗抑制LHRH-PE40与Hep-2、A549细胞的结合,结合力随着LHRH浓度的增高而递减,对LHRH-PE40和LO2细胞结合影响较小。结论 LHRH-PE40可特异性结合癌细胞表面LHRH受体,从而发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。

    2012年05期 v.25 593-596页 [查看摘要][在线阅读][下载 370K]
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  • 重组Kringle5蛋白发酵工艺的优化

    陈显久;杨利军;解军;张悦红;牛勃;

    目的建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺。方法应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度(A60)0,称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kringle5蛋白表达量。结果重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为:BP-5菌种,2×YT培养基,30℃基础培养时间7 h,42℃诱导培养时间6 h,pH值为7.0,空气流量为1 vvm,溶氧控制大于50%,搅拌转速控制为800~1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4%,菌体干重达(14.28±0.11)g/L。结论已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础。

    2012年05期 v.25 597-600页 [查看摘要][在线阅读][下载 294K]
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诊断制剂

  • 马流感病毒2个亚型单克隆抗体的制备及鉴定

    肖成蕊;王作友;宋战昀;孟庆峰;孟日增;王楠;

    目的制备马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7(简称H7N7)和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8(简称H3N8)分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。结果筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4。3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为IgG2a,轻链为κ链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576。2个亚型的单抗均具有良好的特异性。获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变;冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值。结论成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础。

    2012年05期 v.25 601-604页 [查看摘要][在线阅读][下载 269K]
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  • 结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品的研制

    陈保文;沈小兵;苏城;王国治;

    目的研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品。方法将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液;膜过滤法制备最低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数;对最低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价。结果阳性参考品由15份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由10份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,最低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37R)v单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成。结论研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制。

    2012年05期 v.25 605-607页 [查看摘要][在线阅读][下载 121K]
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临床研究

  • 触珠蛋白在急性心肌梗死患者血清中的表达

    范晓卿;周义文;秦晓林;何咏婷;刘银河;王毅;涂植光;

    目的探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路。方法收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达。结果 AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似;MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P<0.05)。结论 Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物。

    2012年05期 v.25 608-610页 [查看摘要][在线阅读][下载 191K]
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技术方法

  • 表达TNFR-Fc的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺的放大及其活性检测

    王一婷;雷云;黄鹂;谢奎;杨依丽;陈宝琼;谢秋玲;洪岸;熊盛;

    目的观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性。方法采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5 L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度;经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ELISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测。结果重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5 L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定;纯化的融合蛋白纯度在94%以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应。结论明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础。

    2012年05期 v.25 611-614+622页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K]
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  • GX1-rmhTNFα工程菌发酵及表达产物的纯化

    肖佳佳;吴守振;薛晓静;吴开春;

    目的全面检定GX1-rmhTNFα工程菌,并建立稳定的发酵及纯化工艺。方法对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定,挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养;采用5 L发酵罐,32℃培养工程菌至菌体A600值达4~6时,42℃诱导约4 h后收菌,发酵过程控制pH值在7.2,溶氧在30%左右,采用梯度流加的方法补料,连续发酵3批,验证发酵工艺的稳定性;发酵产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后,经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化,收集洗脱峰进行纯度、浓度、活性及Western blot分析。结果工程菌经全面检定,证实构建正确,目的蛋白表达量不低于10%,菌种稳定性较好,呈典型的大肠杆菌特征,适合建立工程菌菌库;连续发酵3批,湿菌收量均不低于200 g,目的蛋白表达水平均在10%以上;目的蛋白经柱层析纯化,最终纯化产物蛋白含量为0.901 mg/ml,活性为5.97×108IU/ml,纯度可达95%以上,Western blot分析显示,目的蛋白可与鼠抗人TNF单抗特异性结合。结论初步建立了稳定可行的GX1-rmhTNFα融合蛋白的发酵及纯化工艺。

    2012年05期 v.25 615-619页 [查看摘要][在线阅读][下载 475K]
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  • 高产蛋白酶地衣芽孢杆菌株的紫外诱变

    王长远;罗梦晓;

    目的紫外诱变提高地衣芽孢杆菌的产蛋白酶能力。方法紫外线照射法诱变地衣芽孢杆菌,绘制诱变曲线,确定紫外诱变条件。采用福林酚法测定酶活力,经初筛和复筛筛选蛋白酶高产菌株,并对所选育的高产菌株进行遗传稳定性研究。结果最佳紫外线照射时间确定为120 s,菌落的总致死率为65.58%;经过初筛和复筛,选育出蛋白酶高产菌株B-14,蛋白酶活力为2 922.90 U/ml,比出发菌株B提高了23.81%;B-14菌株经5次传代,其蛋白酶活力在2 754.27~3 203.95 U/ml之间,变化范围不超过10%。结论该实验成功选育出遗传性能稳定的蛋白酶高产菌株B-14。

    2012年05期 v.25 620-622页 [查看摘要][在线阅读][下载 153K]
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  • HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量

    赵辉;李增礼;周乐春;储成风;倪晓燕;王荣海;宋礼华;

    目的采用HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量。方法按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的HPLC方法进行专属性验证、系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、最低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量进行检测。结果该测定方法具有专属性;系统适应性良好;线性范围为0.031 25~2.5 mg/ml,R2=0.999 7,线性关系良好;实验内重复性,峰面积和浓度的RSD值分别为0.71%和0.56%;日间重复性,保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47%和2.76%;最低检测限为10 mg/L;加样回收率分别为101.99%、99.96%和102.2%,RSD=1.16%;3批人干扰素α2b注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950 mg/ml,分别为标示量的94.0%、93.6%和95.0%。结论本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定。

    2012年05期 v.25 623-624+629页 [查看摘要][在线阅读][下载 185K]
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  • 放射致小鼠骨髓造血细胞损伤与衰老模型的建立

    闫玲玲;姜蓉;李春莉;左国伟;高焕庆;陈地龙;龙轩;王建伟;

    目的建立放射致小鼠骨髓细胞损伤与衰老模型。方法取50只小鼠,随机分为对照组和4.0、6.5、8.5和10.5 Gy不同剂量照射实验组,观察小鼠30 d存活率。另取20只小鼠,分别于6.5 Gy照射后第1、3、7和30天检测外周血血常规及骨髓单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs)数的变化,观察骨髓造血细胞大小及形态并计数集落数量,流式细胞仪检测骨髓MNCs凋亡情况,采用衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal活性,细胞免疫荧光法分析p16Ink4a蛋白的表达水平。结果小鼠30 d存活率对照组和4.0 Gy实验组均为100%,6.5 Gy实验组为80%,8.5及10.5 Gy实验组均为0。6.5 Gy一次性全身照射后第1、3、7、30 d,小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓MNCs数、CFU数量均下降,以照射后第3天最明显,第7天开始恢复正常;照射后骨髓MNCs凋亡率与对照组[(7.32±1.87)%]相比,均明显升高(P<0.05),第3天最高[(35.71±0.30)%],随时间的延长凋亡率逐渐下降;SA-β-gal染色和细胞免疫荧光染色结果显示,照射后阳性细胞率与对照组比较,均明显升高(P<0.05),以第3天最高,随时间延长逐渐降低。结论以6.5 Gy照射,可建立小鼠的骨髓造血细胞损伤与衰老模型,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础。

    2012年05期 v.25 625-629页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K]
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  • 直接用于PCR反应的芽胞杆菌基因组DNA抽提改良方法的建立

    胥振国;蔡玉华;袁星;刘修树;江昌俊;

    目的建立一种直接用于PCR反应的芽胞杆菌基因组DNA提取的改良方法。方法用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)-溶菌酶-冻融裂解法提取蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌基因组DNA,用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA在230、260、280 nm波长下的A值,计算DNA浓度,并以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。结果采用改良CTAB法提取的基因组DNA A260/A280值均在1.8~2.0之间,A260/A230值均大于2.0,DNA浓度均大于110μg/ml;PCR扩增产物均可见1 500 bp的清晰条带,浓度较高,未见其他特异条带。结论 CTAB-溶菌酶-冻融裂解法提取芽胞杆菌基因组DNA简单、高效,并可用于PCR反应,适用于临床分子生物学检验。

    2012年05期 v.25 630-632页 [查看摘要][在线阅读][下载 224K]
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  • 简化法与传统方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色效果的比较

    刘良忠;胡建娥;常世川;熊德明;朱川;刘必宽;陈睿;谭建军;李刚;

    目的分别采用简化法与传统方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色,通过流式细胞术检测比较两种方法的染色效果。方法取健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别经佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、离子霉素(Ionomycint,Ion)和莫能霉素(Monensin)刺激4 h,分别以传统法(细胞刺激后进行表面染色,再固定,破膜,行细胞内染色)和简化法(细胞刺激后直接固定,破膜,在不同时间段进行膜上膜内同时染色)进行细胞内染色。样本经抗体标记后,采用流式细胞术检测淋巴细胞的百分率。结果简化法染色检测Th1细胞的百分比与传统染色方法相比,差异无统计学意义(P>0.05);而简化法染色检测Th17细胞的百分比明显高于传统方法(P<0.05)。与传统法比较,应用简化法,细胞于破膜后固定0、48、96 h染色,检测Th2细胞的百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结论简化法简化了操作流程,有利于流式细胞术的质控,可替代传统染色方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色。

    2012年05期 v.25 633-637页 [查看摘要][在线阅读][下载 542K]
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  • 植物乳杆菌真空干燥保护剂配方的优化

    于长青;姚笛;钱丽丽;孙丽建;

    目的采用响应面法对植物乳杆菌真空干燥保护剂配方进行优化。方法在单因素试验的基础上,利用响应面法(Response surface method,RSM)中的中心复合设计(Central composite design,CCD)进行试验,通过试验数据拟合得到二阶响应面模型,最终确定最优实验条件及最佳保护剂配比。检测以优化的保护剂配方制备的菌粉的稳定性。结果优化的保护剂配方为:甘油3.59%,VC1%,谷氨酸钠2%,L-半胱氨酸0.5%,海藻糖15%,蔗糖5%,脱脂乳粉42.82%,玉米淀粉15%,玉米面15%。用此配方保护剂真空干燥样品时,可使菌体存活率达52.86%,与理论预测值(54.18%)较接近。以优化的保护剂配方制备的菌粉于4℃条件下保存12个月,仍有107cfu/g的活菌量。结论已优化了植物乳杆菌真空干燥保护剂配方,对植物乳杆菌的应用、活菌产品的质量稳定及新产品的研发均有一定的指导意义。

    2012年05期 v.25 638-642页 [查看摘要][在线阅读][下载 343K]
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综述

  • 手足口病病原EV71和CA16的比较

    张文慧;井申荣;

    手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原。尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题。本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述。

    2012年05期 v.25 643-645+652页 [查看摘要][在线阅读][下载 155K]
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  • 朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法的研究进展

    李莎;万家余;李忠义;

    朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白(PrPS)c组成。朊病毒的复制就是在痕量PrPSc的催化下,正常朊蛋白(PrPC)向其错误折叠形式的转化。本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类"PCR"高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法。本文针对朊病毒"类PCR"高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述。

    2012年05期 v.25 646-648页 [查看摘要][在线阅读][下载 120K]
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  • 人类输血传播病毒基因型别及流行率的研究进展

    刘畅;井申荣;

    Torque teno病毒是一种与转氨酶升高有关的新型DNA肝炎病毒,以患者名字命名,由于可通过输血传播,也称输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV)。TTV的ORF1中N22区域大约230 bp的序列(nt1939~2160)为基因分型主要依据。在亚洲、美洲和欧洲等地的一些国家,发现G1型为主要类型,在巴西和韩国等则以G2型为主要类型。正常人群和献血员中都有较高阳性率,中年人群感染率明显高于其他年龄段人群。本文对近几年人类TTV基因型别及流行率的研究进展作一综述。

    2012年05期 v.25 649-652页 [查看摘要][在线阅读][下载 155K]
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  • 诱导性多能干细胞重编程诱导方式的研究进展

    赵巍;陈焕;冯业童;刘朋飞;

    2006年,研究人员将4个转录因子(Oct4、Sox2、cMyc和Klf4)通过逆转录病毒导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞,称之为"诱导性多能干细胞"(Induced pluripotent stem cells,iPS cells)。这种方法可稳定地将高度分化的成体细胞重编程为具有多能性的干细胞,应用于疾病治疗,可避免传统胚胎干细胞应用所受到的伦理道德等社会因素的限制。因此,该技术的诞生在很大程度上推进了干细胞理论及临床应用研究的发展。目前,有多种途径诱导体细胞重编程为iPS细胞,本文就近年iPS细胞重编程的诱导方式作一简要综述。

    2012年05期 v.25 653-656页 [查看摘要][在线阅读][下载 149K]
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  • 噬菌体裂解酶的研究进展

    张瑞安;刘军;冯书章;

    噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶,具有酶活性和底物特异性。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶即溶菌酶、酰胺酶和内肽酶的基因。本文综述了噬菌体裂解酶重组及其应用的研究,并探讨了近年来重组裂解酶的研究进展。

    2012年05期 v.25 657-660页 [查看摘要][在线阅读][下载 169K]
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