中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

基础研究

  • 肺炎球菌表面蛋白A的原核表达及其作为多糖结合疫苗载体的可行性

    李启明;唐玉龙;张学峰;靳玉琴;马智静;张靖;

    目的原核表达肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA),并探讨其作为多糖结合疫苗候选载体的可行性。方法合成PspA基因,定向克隆至pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pET-30a-rPspA,转化E.coli Sta(rDE3)菌株,IPTG诱导表达。表达产物经Ni离子亲和层析纯化后,经Western blot鉴定。取破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)及纯化的rPspA,分别与A群脑膜炎球菌多糖(Group A meningococcal capsular polysaccharide,GAMP)通过溴化氰活化法进行偶联,获得rPspA-GAMP与TT-GAMP多糖蛋白结合物,对其进行纯化及检定。多糖结合物分别以滴鼻和肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,评价其诱发的体液免疫和黏膜免疫水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达产物主要以可溶形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%,经纯化后纯度可达90%,可与His单抗特异性结合;肌肉注射途径显示,两种蛋白载体的结合物均能诱发较高水平的体液免疫,不同载体间差异无统计学意义(P>0.05);滴鼻途径显示,载体蛋白rPspA的结合物刺激产生sIgA的能力优于传统载体TT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论原核表达并纯化了rPspA,其具有新型多糖蛋白载体的潜力,也可作为黏膜投递型多糖结合疫苗的候选载体。

    2011年12期 v.24 1381-1384页 [查看摘要][在线阅读][下载 281K]
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  • NF-κB受体激活因子配体在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性

    杨忠东;何成;

    目的在大肠杆菌中表达并纯化NF-κB受体激活因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL),并检测其生物学活性。方法 PCR扩增RANKL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RANKL,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达和表达形式。表达产物经镍离子柱亲和层析、阴离子交换层析及阳离子交换层析进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot检测其反应原性,BCA试剂盒测定蛋白浓度,并经MTT法及RAW264.7细胞分化试验测定其生物学活性。结果重组表达质粒pET-28a-RANKL经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组RANKL蛋白相对分子质量约为20 000,部分以包涵体形式存在;经纯化后纯度可达98.8%,可与相应抗体反应形成特异条带,蛋白浓度为56.72μg/ml,体外活性试验显示,RANKL具有良好的生物学活性。结论成功原核表达了RANKL,纯化的重组RANKL具有生物学活性,为骨代谢调控机制的研究及相关药物的开发提供了材料。

    2011年12期 v.24 1385-1390页 [查看摘要][在线阅读][下载 597K]
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  • 随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白的纯化及鉴定

    王健;孙成金;李莉莉;陈祥鹏;李军;王恒;张振龙;

    目的纯化随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白,并进行各项鉴定。方法对BL21(DE3)-M.RCAg-1/pDS-ex工程菌发酵产物进行纯化,对纯化的M.RCAg-1蛋白进行各种理化性质鉴定;采用Western blot法检测其反应原性;以不同剂量的M.RCAg-1蛋白免疫BALB/c小鼠及新西兰大白兔,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价;间接荧光免疫法(IFA)分析免疫血清对天然疟原虫抗原的识别;酶联免疫斑点试验检测特异性鼠T淋巴细胞的活化及细胞因子的分泌;体外生长抑制试验检测免疫兔血清对恶性疟原虫生长的影响。结果 M.RCAg-1蛋白表达量约为菌体总蛋白的30%,浓度为1.5 mg/ml,纯度可达95%左右,等电点为5.0;内毒素残留量均小于2.5 EU/mg,宿主蛋白残留量为0.08%,N-末端氨基酸序列正确;可与相应鼠单抗特异性结合;免疫小鼠血清抗体水平随着免疫次数和免疫剂量的增加而升高,20及30μg剂量组在末次免疫后,血清抗体滴度均可达1∶1 031 707;各免疫组小鼠血清均能识别恶性疟原虫天然抗原,且呈抗原剂量依赖性;10、20和30μg剂量组能刺激相应特异性脾淋巴细胞显著增殖(P<0.01)及分泌IFNγ和IL-4(P<0.01),并能较好地抑制疟原虫体外生长。结论纯化的M.RCAg-1蛋白理化性质稳定,具有较强的免疫原性,能激发可持续、高滴度的特异性抗体,并能诱发显著的T细胞应答,是极具潜力的候选疫苗蛋白,具有较好的开发前景。

    2011年12期 v.24 1391-1395+1399页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K]
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  • 乙型肝炎疫苗新型佐剂BW006对小鼠脾树突细胞表型和功能的影响

    张现臣;何鹏;胡忠玉;邱少辉;方鑫;梁争论;

    目的研究新型佐剂BW006(含CpG基质的寡核苷酸)与重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)对小鼠脾树突细胞(Dendritic cell,DC)表型和功能的影响。方法应用BW006和/或HBsAg体外刺激小鼠脾DC,流式细胞仪检测DC膜表面分子CD80和CD86的表达水平,分支DNA(bDNA)法检测IL-12p35和IL-12p40 mRNA的表达水平,ELISA检测IL-12p70的分泌水平。结果 5μg BW006体外刺激DC 3和6 h,IL-12p35和IL-12p40的mRNA表达水平分别达峰值,刺激6 h时较刺激前分别增加了约1.2和26倍;刺激12和24 h,CD86和CD80的表达分别达峰值(74.53%和36.10%);刺激24 h,DC分泌IL-12p70的水平达高峰(3 311.20 pg/ml);5μg BW006联合40μg HBsAg体外刺激DC 24 h,DC表面分子CD80和CD86的表达阳性率分别为25.17%和51.65%,IL-12p70分泌水平达2 699.70 pg/ml,与BW006单独刺激组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BW006具有早期活化DC,上调DC表面协同刺激分子CD80和CD86表达及诱导IL-12分泌的功能,作为乙肝疫苗的新型佐剂,具有较好的应用前景。

    2011年12期 v.24 1396-1399页 [查看摘要][在线阅读][下载 190K]
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  • 定向进化法提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性

    刘畅;田国贺;郑柏松;张作明;冯雁;

    目的提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性,并分析该酶的底物选择性与酶结构的关系。方法应用定向进化法,对APE1547突变体P01(APE1547/R526V)的催化结构域基因进行易错PCR后,与推进器结构域连接,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL,在双重选择压力下(高温及活性测定),应用高通量筛选方法筛选突变体,并针对特定的突变位点进行进一步饱和突变筛选,得到对长链酰基酯底物pNP-C12选择性提高的突变体酶。通过热稳定性测定、催化动力学分析和分子动力学模拟分析突变对酶结构和功能的影响。结果从近万个随机突变体库中筛选到3株优势突变体,经测序得到4个氨基酸突变位点(379、394、489和560);对4个位点氨基酸分别进行饱和突变筛选,得到活性最高的突变体E01(APE1547/R526V/T560W),在80℃,P01和E01的半衰期分别为123和77 h;催化长链酰基酯底物pNPC-12的效率(kcat/Km)提高约14倍。分子动力学模拟分析表明,560位点突变可能阻碍底物pNP-C12沿次要通道进入酶分子内部。结论定向进化结合饱和突变的方法可有效提高嗜热酯酶对长链酰基酯底物的活性和选择性;嗜热酯酶APE1547内部的底物交通对酶的底物选择性具有重要影响,E01突变体通过显著改善pNP-C12在酶内部的底物交通提高了对pNP-C12的选择性,并对酶分子的稳定性有较大影响。

    2011年12期 v.24 1400-1404页 [查看摘要][在线阅读][下载 345K]
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  • 携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌工程菌株的构建及其活性

    杨志华;赵曼;哈小琴;董芳;张尚娣;贾庆华;

    目的构建携带肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)基因的减毒沙门菌工程菌株,并检测其体外活性。方法从人胎盘cDNA文库中PCR扩增人HGF基因,克隆至真核表达载体pcK上,构建重组表达质粒pcKH,电穿孔法转入减毒沙门菌Ty21a中,获得携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株。将该菌株转染胃黏膜上皮细胞GES-1,48 h后采用ELISA方法检测上清中HGF蛋白的表达水平,MTT法检测不同浓度HGF表达产物对GES-1细胞增殖活力的影响。结果克隆的人HGF基因序列与GenBank中登录的人HGF cDNA序列(M60718.1)完全一致;重组表达质粒pcKH经双酶切鉴定构建正确;成功构建了携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株,可有效转染GES-1细胞,并表达活性HGF蛋白(14~16 ng/6×105个细胞),其可显著刺激GES-1细胞增殖(P<0.05)。结论已成功构建携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株,其可能具有在体内治疗胃肠疾病的潜能。

    2011年12期 v.24 1405-1408+1416页 [查看摘要][在线阅读][下载 273K]
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  • 重组人促卵泡激素在CHO细胞中的表达

    何太平;唐菁燕;徐珑;宋春雷;谭晓晶;聂艳桃;杨波;雷韬;

    目的在CHO细胞中表达重组人促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)。方法用内部核糖体进入位点序列(IRES)将FSHα和β亚基在基因水平上进行拼接,并在同一启动子的控制下构建重组真核表达质粒pcDNA5/dhfr/FSH,转染CHO细胞,筛选并建立稳定表达工程细胞株,并对工程细胞的生长和表达进行分析。结果重组真核表达质粒pcDNA5/dhfr/FSH经双酶切和测序证明构建正确;转染CHO细胞获得高的阳性克隆率(80.65%),经MTX加压和克隆筛选获得稳定表达工程细胞株D5;D5细胞株在无血清摇瓶批次培养中FSH的表达量为2.5 IU/ml,在培养参数可控的生物反应器中FSH的表达量为摇瓶中的2倍多,达6 IU/ml。结论建立了一种在CHO细胞中表达异二聚体糖蛋白的方法,获得的工程细胞适应无血清培养且易于扩大培养,在生物反应器中可获得高的表达量,且具有进一步优化提高表达量的潜力。

    2011年12期 v.24 1409-1412页 [查看摘要][在线阅读][下载 252K]
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  • 靶向Y-box结合蛋白-1基因的shRNA质粒的构建及鉴定

    邱欣欣;涂植光;孔飞飞;陈光辉;匡文斌;成凤;钟梁;

    目的构建靶向Y-box结合蛋白-1(Y-box binding protein-1,YB-1)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒并鉴定其抑制率。方法设计并合成3对针对YB-1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒pGenesil-1连接,构建3个重组质粒pGSi1、pGSi2和pGSi3,脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞中YB-1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组质粒pGSi1、pGSi2和pGSi3经酶切及测序证明构建正确;转染MDA-MB-231细胞后,YB-1基因在mRNA和蛋白水平的表达均降低,其中pGSi2的抑制效果最好,在mRNA和蛋白水平的抑制率分别为57.4%和90%。结论成功构建了靶向YB-1基因的shRNA表达质粒,并筛选出1种对YB-1基因有显著抑制作用的shRNA,为进一步研究YB-1对乳腺癌细胞侵袭、迁移和多药耐药性的影响奠定了基础。

    2011年12期 v.24 1413-1416页 [查看摘要][在线阅读][下载 263K]
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  • 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用

    崔文禹;李媛媛;单璞;凌媛;李计来;徐静;

    目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。

    2011年12期 v.24 1417-1420页 [查看摘要][在线阅读][下载 267K]
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  • 幽门螺杆菌NCTC11637株Hp1501蛋白的原核表达与纯化

    杨继文;杨致邦;敬保迁;于拽拽;熊玉霞;王朝丽;冯莉;

    目的原核表达并纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC11637株Hp1501蛋白。方法 PCR扩增H.pylori NCTC11637株Hp1501基因编码功能区序列Hp1501a,定向克隆至pQE30载体,构建重组原核表达质粒pQE30-Hp1501a,转化E.coli XL1-blue,IPTG诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式。用Ni-NTA His柱对重组蛋白进行纯化。结果重组表达质粒pQE30-Hp1501a经双酶切鉴定构建正确,测序分析表明插入基因序列完全正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为37 000,表达量约占菌体总蛋白的21%,主要以包涵体形式存在,可与兔抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的重组蛋白纯度达91%。结论成功原核表达并纯化了H.pylori NCTC11637株Hp1501蛋白,为H.pylori外膜蛋白的生物学功能和疫苗的研究奠定了基础。

    2011年12期 v.24 1421-1424页 [查看摘要][在线阅读][下载 313K]
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  • C型肉毒梭菌的鉴定及其神经毒素基因全序列测定

    高建军;张超;毛晓燕;曹馨匀;

    目的对3株C型肉毒梭菌进行鉴定,并选择其中1株进行基因全序列测定。方法对3株C型肉毒梭菌(C6514、C314/91和CAXA)进行生化鉴定、检出试验、确证试验、毒力测定、毒素定型试验,并对C6514株进行神经毒素基因全序列测序。结果 3株菌均能发酵葡萄糖,不能发酵乳糖,不能发酵牛奶和形成吲哚;3株菌均为产毒株;C6514株毒力较高,为2×104 LD50/ml;加C型或混合型肉毒诊断血清或加明胶磷酸盐缓冲液(GPB)煮沸均可中和或灭活C型肉毒梭菌产生的毒素;BoNT/C测得的序列拼接后与GenBank中序列号为D90210的基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。结论 3株肉毒梭菌均为典型的C型肉毒梭菌。

    2011年12期 v.24 1425-1429页 [查看摘要][在线阅读][下载 552K]
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  • 重组破伤风毒素C片段的纯化及其免疫原性

    陈继军;毛晓燕;王建锋;乔玉玲;

    目的建立大肠杆菌表达的重组破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,并检测其免疫原性。方法取超声破碎后的重组菌上清,经硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗体水平。结果经3步纯化,目的蛋白纯度达96.7%;经还原及非还原SDS-PAGE分析蛋白条带一致,相对分子质量约为50 000,不含多聚体,为单体蛋白;纯化的TTc可刺激小鼠产生免疫应答,但血清抗体水平显著低于破伤风类毒素组(P<0.05)。结论已建立了大肠杆菌表达的重组TTc的纯化工艺,纯化的TTc对小鼠具有免疫原性。

    2011年12期 v.24 1430-1432+1441页 [查看摘要][在线阅读][下载 311K]
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  • 振荡磁场作用下超顺磁性异烟肼PELA微球体内药物释放规律

    张玉坤;朱朝敏;罗聪;黄华;周恒;

    目的探讨超顺磁性异烟肼(Isoniazide,INH)聚乳酸-聚乙二醇共聚物(Polylactide-polyethylene glycol copolymers,PELA)微球(Superparamagnetic isoniazide PELA microspheres,SPIPM)在振荡磁场作用下体内异烟肼的释放规律,并建立异烟肼HPLC检测方法。方法采用化学共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒,复乳化(W/O/W)溶剂蒸发法制备SPIPM,离心,洗涤,HPLC法检测洗涤液中异烟肼的含量,计算载药量和包封率;并检测SPIPM的表征;选取18只新西兰大白兔,随机分为SPIPM外加振荡磁场干预组,SPIPM组和异烟肼组,给药后每隔15 min取静脉血,采用HPLC法测定异烟肼的血药浓度。结果 SPIPM的载药量为(7.5±0.5)%,包封率为(50±1.5)%;微球表明光滑,形态圆整,分散性良好,粒度分布基本呈正态分布,粒径分布范围窄。与单纯注射异烟肼相比,SPIPM能延缓异烟肼释放,外加振荡磁场时,可重复提高动物体内SPIPM中异烟肼的释放量。结论超顺磁性异烟肼PELA微球具有缓释性,振荡磁场可明显促进超顺磁性异烟肼PELA微球中异烟肼的释放。

    2011年12期 v.24 1433-1436页 [查看摘要][在线阅读][下载 280K]
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  • 鸭大肠杆菌强毒株的血清型及生物学特性分析

    程龙飞;陈红梅;李宋钰;傅光华;施少华;万春和;黄瑜;

    目的鉴定鸭大肠杆菌强毒株的血清型,并分析其生物学特性。方法收集2005~2010年间福建及邻近省份的疑似大肠杆菌病死亡鸭,进行细菌分离鉴定;经易感鸭皮下注射,测定其致病性;凝集试验确定血清型;纸片法进行药敏试验;PCR法检测毒力基因。结果共分离鉴定鸭源大肠杆菌289株,其中强毒菌株255株,分属于19个血清型,O78血清型占52.5%,为主要血清型。134株O78血清型强毒株均对多黏菌素B和红霉素耐药,80%以上的菌株对恩诺沙星等7种药物耐药,仅有不到20%的菌株对壮观霉素等5种药物耐药。papC基因的检出率达100%;fimC基因的检出率与分离菌的年份无关,维持在80%以上;2005和2006年分离的菌株,irp2和fyuA基因的检出率均为100%,随后呈下降的趋势。结论 O78血清型是鸭大肠杆菌强毒分离株中的主要血清型,为鸭大肠杆菌灭活疫苗的首选血清型;壮观霉素、卡那霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、头孢唑啉是近期防治鸭大肠杆菌病的首选药物。

    2011年12期 v.24 1437-1441页 [查看摘要][在线阅读][下载 247K]
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  • 鸡MDV L-meq基因与该病毒感染的鸡胚成纤维细胞中p53基因的相关性

    丁洪波;丁旭;卜秀娟;吴涵;潘风光;

    目的探讨鸡马立克病病毒(Marek disease virus,MDV)L-meq基因与MDV感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken em-bryo fibroblast,CEF)中p53基因的相关性。方法双酶切质粒pMD18-T-L-meq,获得L-meq基因片段,克隆入载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA-L-meq,转染CEF细胞,利用实时定量RT-PCR检测转染细胞中p53基因mRNA的表达量,TRAP法检测转染细胞中端粒酶的活性,流式细胞术检测转染细胞细胞周期的变化。结果重组真核表达质粒pcDNA-L-meq经双酶切鉴定构建正确。转染L-meq基因后48 h,CEF细胞中p53基因mRNA的表达量略有升高,72 h时下降。转染L-meq基因后48、72 h,CEF细胞的端粒酶活性比未转染的CEF细胞分别高16、1个活力单位。转染L-meq基因后48 h,CEF细胞G0/G1期比例较转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞(对照)显著增加(P<0.01);转染后72 h,实验组G0/G1及G2/M期细胞比例较对照组显著增加(P<0.01);转染后48和72 h,S期细胞比例较对照组均显著减少(P<0.01)。结论 L-meq基因对MDV的增殖具有一定程度的抑制作用,在病毒的增殖过程中可能为一种转录抑制因子。

    2011年12期 v.24 1442-1444+1453页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K]
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  • 小鼠胰岛素诱导基因1 siRNA稳定表达细胞株的建立及其对细胞胆固醇代谢的影响

    柯大智;陈庆伟;李桂琼;邓玮;莫显刚;

    目的构建并筛选针对小鼠胰岛素诱导基因1(insulin induced gene 1,insig1)siRNA的特异性表达质粒,建立稳定转染细胞株,并观察其对小鼠巨噬细胞RAW264.7胆固醇代谢的影响。方法根据GenBank中登录的insig1基因序列及RNA干扰原则,设计3个阳性克隆及1个阴性克隆序列,定向克隆入pGenesil-1质粒,构建insig1 shRNA真核表达质粒,测序鉴定后,脂质体法转染RAW264.7细胞,筛选干扰效果最佳的质粒,将其转染入RAW264.7细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中insig1基因的转录水平及蛋白的表达水平,油红O染色观察转染细胞中胆固醇含量的变化。结果酶切及测序结果证实,insig1基因shRNA表达质粒构建正确,其中si-2为干扰效果最佳的质粒;在稳定转染的RAW264.7细胞中,si-2组insig1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平较阴性质粒组和未转染组明显降低(P<0.05),油红O颗粒含量最多。结论成功建立了insig1 siRNA稳定表达细胞株,体外模型证明了对insig1基因的干扰可促进细胞胆固醇摄取。

    2011年12期 v.24 1445-1449页 [查看摘要][在线阅读][下载 958K]
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  • 辅酶Q_(10)对中波紫外线致小鼠成纤维细胞损伤的拮抗作用

    宋昕恬;吴晓刚;张琨;高峰;

    目的观察辅酶Q1(0Coenzyme Q10,CoQ10)对中波紫外线(Ultraviolet radiation B,UVB)致小鼠成纤维细胞NIH3T3损伤的拮抗作用。方法采用血清药理学方法制备含有及不含有CoQ10的血清;将NIH3T3细胞接种于12孔培养板,分别接受不同剂量UVB(0、10、30、60和90 mJ/cm2)照射,MTT法检测细胞增殖活力;分别加入10、20和40μl含药血清,并设空白对照组和不含药对照血清组,经UVB照射后,MTT法检测细胞增殖活力;取细胞培养上清液,使用丙二醛(MDA)试剂盒测定MDA的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒分别测定SOD、CAT和GSH-Px的活性。结果经大剂量(30、60、90 mJ/cm2)UVB照射,NIH3T3细胞增殖活力明显降低(P<0.01),UVB照射后,40μl含药血清组较不含药对照血清组细胞增殖活力明显增强(P<0.05),不含药对照血清组与空白对照组相比,MDA含量明显升高,SOD、GSH-Px和CAT的活性明显降低(P<0.05);40μl含药血清组与不含药对照血清组相比,MDA含量明显降低,SOD和GSH-Px的活性明显升高(P<0.05);但CAT活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CoQ10能够显著的拮抗UVB照射所引起的小鼠成纤维细胞氧化损伤。

    2011年12期 v.24 1450-1453页 [查看摘要][在线阅读][下载 201K]
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预防制品

  • 重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原制备工艺的建立

    胡丽娜;常娅莉;魏东;万艳;马维民;傅林锋;王革;吴智远;韩少波;王秉翔;

    目的建立稳定、高效的重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原工程菌的发酵与纯化工艺。方法研究LcrV工程菌pET-V/BL21(DE3)在试管和三角摇瓶中的生长和表达规律,对种子培养基、IPTG诱导时机、诱导时间及诱导浓度进行优化,并放大至30 L发酵罐培养,建立稳定的发酵工艺。收获菌体,经冻融、离心收集蛋白溶液,高压匀浆处理后,分别采用Q.Sepharose HP阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 FF(hs)疏水层析及Superdex 75 pg凝胶过滤层析三步柱层析纯化,建立稳定的纯化工艺,连续纯化3批,并按《中国药典》三部(2010版)的相关要求进行全面检定。结果经优化的条件培养及诱导表达,工程菌的收菌密度(A600值)可达34,LcrV抗原的表达量达36%,含量为1.6 g/L。发酵产物经柱层析纯化,LcrV产量高于140 mg,纯度大于95%,蛋白总回收率达8.5%以上。各项检定指标均符合《中国药典》三部(2010版)的相关要求。结论已建立了稳定的、适合规模化生产的LcrV制备工艺,为新型鼠疫组分疫苗的研制奠定了基础。

    2011年12期 v.24 1454-1459页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K]
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  • 人用狂犬病疫苗株aGV的生物学特性

    郭秀侠;杨屹;崔文广;苗丽;丁丽丽;韩轼奇;王亚军;李宇辉;

    目的研究人用狂犬病疫苗株aGV的生物学特性。方法取狂犬病病毒3aG株,接种于Vero细胞适应性传代,按照《中国药典》三部(2010版)要求建立毒种库,并进行全面检定:电镜观察毒种的形态结构,测定毒种的糖蛋白基因序列,直接免疫荧光法检测毒种的毒力,动物试验法和细胞培养法检测外源因子,免疫小鼠检测毒种的免疫原性,小鼠脑内中和试验法鉴定毒种的特异性,进行外周致病性试验,检测单次病毒收获液的效力。检测应用该毒株制备的疫苗的抗原性,并与上市疫苗进行比较。结果 aGV毒种在电镜下呈典型的子弹状,可见病毒包膜、刺突等结构;aGV株与3aG、PV、CTN-1、CVS株及街毒株糖蛋白基因序列的同源性分别为99%、92%、84%、91%、84%;病毒毒力逐代提高,第8~12代毒力稳定在108~109 FFU/ml;该病毒在Vero细胞上具有良好的适应性,外周致病性降低,无外源因子污染;aGV9和aGV12的中和指数分别为1 000和7 079,3个批次的aGV9免疫保护指数分别为38 019、7 943和13 489;中和抗体检测结果显示,试验组与对照组之间中和抗体效价差异无统计学意义(P>0.05)。结论本研究适应的狂犬病病毒aGV株有望作为人用狂犬病疫苗株应用于生产。

    2011年12期 v.24 1460-1464页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K]
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治疗制品

  • 注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用

    陈云祥;徐潘生;张立将;由振强;宋翼升;张升;李红文;黄敏;王文祥;房健民;宣尧仙;

    目的观察注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)对家兔胚胎及胎仔发育的毒性作用。方法将受精后的雌兔随机分为RCT-18高、中、低剂量组和阴性对照组,每组15只,于妊娠第6~18天分别经皮下注射RCT-18 51.3、14.7、4.4 mg/(kg.d)和0.9%NaCl注射液,每2 d注射1次,共7次。实验过程中每天观察动物的一般反应、体重及摄食量变化,于妊娠第28天解剖孕兔,对着床、吸收胎、死胎、活胎、黄体进行计数,对胎仔的体重、身长、尾长以及外观形态、内脏和骨骼发育等指标进行考察。结果各组孕兔、胚胎形成、胎仔生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等各项指标均无明显异常,与阴性对照组比较,多数指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RCT-18对妊娠家兔未见明显母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性,无致畸作用。

    2011年12期 v.24 1465-1468+1476页 [查看摘要][在线阅读][下载 244K]
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  • 携带颗粒溶素活性肽基因的减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤的治疗作用

    何永林;杨春;张黎;徐蕾;王瑜伟;

    目的观察携带颗粒溶素(Granulysin,GLS)活性肽基因的减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤的治疗作用。方法将小鼠黑色素瘤细胞株B16接种C57 BL/6J小鼠,复制小鼠黑色素瘤模型。将pBudCE4.1-S9K重组沙门菌以不同剂量及不同时间接种于小鼠肿瘤内,检测肿瘤体积,确定最佳治疗剂量和起始时间。将模型小鼠随机分为PBS组、减毒沙门菌组、pBudCE4.1重组沙门菌组和pBudCE4.1-S9K重组沙门菌组,分别采用最佳治疗剂量,在最佳治疗起始时间开始治疗,每周1次,共3次。从成瘤开始,每2 d测量肿瘤的最长径(L)和最短径(S),计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,并观察小鼠的荷瘤存活期。结果小鼠黑色素瘤模型复制成功。重组沙门菌的最佳治疗剂量和起始时间分别为107个/ml和第4天。与PBS组、减毒沙门菌组和pBud-CE4.1重组沙门菌组相比,pBudCE4.1-S9K重组沙门菌组能明显抑制模型小鼠肿瘤的生长,使肿瘤体积增长延缓,并明显延长荷瘤小鼠的存活期。结论 pBudCE4.1-S9K重组减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤具有一定的治疗作用。

    2011年12期 v.24 1469-1472页 [查看摘要][在线阅读][下载 249K]
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  • 液质联用法分析重组抗肿瘤抗病毒蛋白的一级结构

    李萌;裴德宁;陶磊;李永红;王兰;高凯;饶春明;王军志;

    目的通过液质联用法分析重组抗肿瘤抗病毒蛋白(乐复能)的一级结构。方法采用高效液相-电喷雾四级杆飞行时间质谱技术(High performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,HPLC-ESI-Q-TOF-MS)绘制乐复能经胰蛋白酶酶切后的液质肽图,并定位二硫键;采用电喷雾四级杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)测定乐复能的精确相对分子质量。结果乐复能液质肽图的22个理论酶切肽段中,有6个肽段(T2、T5、T12、T15、T19、T22)共7个氨基酸未被检测到,氨基酸覆盖率为96%;通过分析胰蛋白酶酶切液质肽图,发现1种二硫键连接方式:Cys1-Cys29、Cys99-Cys139;质谱测定相对分子质量为19 311.63,与理论相对分子质量(19 311.27)的相对误差为0.000 02%。结论建立了乐复能的液质肽图分析方法,为该类制品的质量控制及其参考品的研制提供了参考。

    2011年12期 v.24 1473-1476页 [查看摘要][在线阅读][下载 195K]
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  • 氨氯地平对小鼠黑色素瘤B16 MMP-9和TIMP-1表达的调节作用

    廖一兰;张旭;徐鑫;孙文娟;

    目的观察氨氯地平对小鼠黑色素瘤B16基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和MMPs组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)表达的调节作用,并探讨其抑制肿瘤转移的作用机制。方法采用MTT法检测氨氯地平对B16细胞增殖的影响;建立C57BL/6小鼠黑色素瘤B16的自发性肺转移模型,随机分为阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺20 mg/kg)、氨氯地平高[10 mg/(kg.d)]、中[3 mg/(kg.d)]、低[1 mg/(kg.d)]剂量组,采用明胶酶谱法检测肿瘤组织中MMP-9的活性;RT-PCR法检测肿瘤组织中MMP-9和TIMP-1基因mRNA的表达;免疫组化SP法检测肿瘤组织中MMP-9和TIMP-1蛋白的表达。结果氨氯地平呈时间和剂量依赖性抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的生长,作用48 h的IC50为11.56μmol/L;氨氯地平可下调肿瘤组织中MMP-9的活性及MMP-9基因mRNA和蛋白的表达,上调TIMP-1基因mR-NA和蛋白的表达。结论氨氯地平通过调节MMP-9和TIMP-1基因的表达发挥其抑制肿瘤转移的作用。

    2011年12期 v.24 1477-1481页 [查看摘要][在线阅读][下载 381K]
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诊断制品

  • 草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

    曾伟伟;王庆;张乐生;刘宝芹;刘永奎;石存斌;曾令兵;吴淑勤;

    目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为51 000,表达量占菌体总蛋白的73%,主要以包涵体形式表达,反应原性良好;制备的多克隆抗体效价约为1∶8 000,且具有较高的特异性。结论成功制备了GCRV HZ08株VP4蛋白高效价多克隆抗体,为VP4蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、草鱼出血病诊断方法的建立及相关基因工程疫苗的研发奠定了基础。

    2011年12期 v.24 1482-1485页 [查看摘要][在线阅读][下载 259K]
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临床观察

  • 静注乙型肝炎人免疫球蛋白(pH 4)预防肝移植术后乙型肝炎病毒感染的Ⅲ期临床观察

    龚曼琳;苗松;廖颖;王玉;王凤水;姚晨;杨汇川;

    目的在常规使用拉米夫定的基础上,观察联合使用静注乙型肝炎人免疫球蛋白(pH 4)(Human hepatitis B im-munoglobulin for intravenous injection,HBIVIG)对乙型肝炎相关性肝病肝移植术后乙型肝炎病毒(HBV)再感染的预防效果及安全性。方法采用多中心、开放、以单用拉米夫定的历史文献和资料作为对照,与在每天口服100 mg拉米夫定常规用药的基础上,联合应用HBIVIG的肝移植术后患者HBV再感染的结果进行比较;以术后第7、30、90、180天时血清中HBsAg阴转率作为主要疗效指标,术后180 d为主要疗效评价时间点,其余为次要评价时间点;以术后第7、30、90、180天时血清HBV DNA定性检查结果为次要疗效指标;以不良反应、严重不良反应的种类、发生频率及抗-HCV检测结果为安全性评价指标。结果本研究138例患者进入安全性分析,125例患者进入疗效分析。联合用药180 d患者血清HBsAg阴转率为95.96%,7 d阴转率为99.08%,30 d阴转率为99.07%,90 d阴转率为99.01%;单用拉米夫定的历史文献数据分析共收集到肝移植患者153例,血清HBsAg在180 d阴转率为89.54%;4家中心收集到的43例单用拉米夫定历史病例180 d血清HBsAg的阴转率为74.42%;共发生不良反应48例,发生率为34.78%,其中,43例(89.58%)与研究药物无关,相关性不良反应为5例,其中与研究药物的关系为"很可能"的为1例(皮疹),与研究药物的关系原始描述为"可疑"的为4例。结论在常规使用拉米夫定的基础上,联合使用静注乙型肝炎人免疫球蛋白(pH 4)对预防乙肝相关性肝病肝移植术后HBV再感染是安全有效的,其疗效优于历史资料单用拉米夫定。

    2011年12期 v.24 1486-1489页 [查看摘要][在线阅读][下载 158K]
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  • 麻疹风疹联合减毒活疫苗的安全性及免疫原性观察

    梁祁;周伟忠;李靖欣;张秋明;刘书强;李薇;李长贵;朱凤才;

    目的观察麻疹风疹联合减毒活疫苗的安全性和免疫原性。方法选择江苏省淮安市楚州区8月龄以上常住健康儿童作为观察对象,分两个阶段观察试验组和对照组麻疹风疹联合减毒活疫苗的安全性及免疫原性,第一阶段入选28名志愿者,主要观察疫苗的安全性,第二阶段入选1 400人,采用单中心、随机、双盲、平行对照的原则,观察两组疫苗接种后不良反应发生率、抗体阳转率、GMT水平及GMT增长倍数。结果第一阶段28名志愿者接种试验疫苗后不良反应总体发生率为14.29%,无3级及3级以上不良反应发生。第二阶段接种后第0~14天内,试验组和对照组预期不良反应总体发生率(分别为28.43%和27.86%)和非预期不良反应/事件总体发生率(分别为3.71%和3.29%)差异均无统计学意义(P>0.05)。第15~28天内,试验组和对照组非预期不良反应/事件发生率(分别为3.43%和3.29%)差异无统计学意义(P>0.05);试验组和对照组血清麻疹抗体阳转率(分别为96.97%和98.44%)及风疹抗体阳转率(分别为96.97%和96.73%)差异均无统计学意义(P>0.05);血清麻疹抗体GMT水平(分别为1∶75.63和1∶64.97)差异有统计学意义(P<0.05),血清风疹抗体GMT水平(分别为1∶276.95和1∶273.13)差异无统计学意义(P>0.05);血清麻疹抗体GMT增长倍数(分别为70.93和60.25倍)差异有统计学意义(P<0.01),血清风疹抗体GMT增长倍数(分别为53.22和52.70倍)差异无统计学意义(P>0.05)。结论试验组麻疹风疹联合减毒活疫苗对8月龄以上健康儿童具有较好的安全性和免疫原性。

    2011年12期 v.24 1490-1493页 [查看摘要][在线阅读][下载 170K]
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  • 孕妇IgG型抗-A/抗-B抗体效价与新生儿溶血病发生率的相关性

    谢敬文;危燕芬;

    目的分析孕妇血清中IgG型抗-A/抗-B抗体效价与母婴血型不合引起的ABO新生儿溶血病(Haemolytic diseaseof the newborn,HDN)发生率的相关性,为HDN的早期诊断和预防提供依据。方法对2005~2008年广州市番禺区各医院送检的1 425份标本和花都区人民医院送检的300份标本(孕妇血型为O型,丈夫为非O型)进行IgG型抗-A/抗-B效价测定,并追踪新生儿HDN的发生情况,分析二者的相关性。结果 1 725份标本抗体筛选试验均未检出同种特异性血型免疫抗体;IgG型抗-A/抗-B抗体效价在16以上的有334份样本,其中有146例于产后1~3 d发生HDN,HDN的发生率随着孕妇IgG型抗-A/抗-B抗体效价的上升而升高,也有个别孕妇IgG型抗-A/抗-B抗体效价高达1 024,但新生儿未发生HDN。结论广州市番禺区和花都区孕妇血清中IgG型抗-A/抗-B抗体效价与HDN的发生密切相关,产前进行IgG型抗-A/抗-B抗体效价测定可预先判断HDN的发生。

    2011年12期 v.24 1494-1495页 [查看摘要][在线阅读][下载 102K]
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实验技术

  • 重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平ELISPOT检测方法的建立

    李媛媛;凌媛;马志新;徐静;

    目的建立检测重组痘苗病毒(Recombinant Tiantan vaccinia,rTV)艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法。方法 rTV艾滋病疫苗经皮内注射BALB/c小鼠,免疫后1~6周,采集小鼠脾细胞,ELISPOT法检测小鼠细胞免疫水平,确定最佳检测时间,并对免疫剂量、肽库刺激浓度进行优化。应用ELISPOT方法对3批rTV疫苗成品进行检测,验证该方法的适用性;按现行检定标准对同批疫苗进行重复检测,验证该方法的重复性;应用ELISPOT和ICS方法同时对rTV疫苗进行检测,验证该方法与ICS法的相关性。结果 rTV艾滋病疫苗最佳免疫剂量为50μl/只,免疫后4周,混合多肽库刺激终浓度为4μg/ml,淋巴细胞分泌IFNγ的水平较高;ELISPOT法适用性和重复性较好,且与ICS法具有较好的相关性(r=0.767,P<0.05)。结论已成功建立了检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法。

    2011年12期 v.24 1496-1499页 [查看摘要][在线阅读][下载 244K]
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  • 乙型脑炎减毒活疫苗抗生素残留量检测方法的验证

    王静;杨烨;刘菊;曲芙莲;

    目的对本所采用的乙型脑炎减毒活疫苗抗生素残留量检测方法进行验证。方法以人用药品注册技术要求国际协调会(ICH Q2A)和《中国药典》二部附录XIX A等指导性文件为依据,选择准确性、重复性、中间精密性、耐用性、线性、检测限和定量限7个验证参数进行验证。结果该法检测高、中、低浓度的庆大霉素标准品的回收率为120.00%~123.33%;检测同一供试品的CV均﹤15%;不同试验人员检测相同供试品和不同批次试剂盒检测相同供试品的差异均无统计学意义(P>0.05);5种条件检测结果差异均无统计学意义(P>0.05),在(37±1)℃温度范围内耐用性良好;庆大霉素标准品在0~8.1 ng/ml范围时,R2=0.992 5≥0.98;该方法的检测限为1.35 ng/ml,定量限为4.50 ng/ml。结论本所用于乙脑减毒活疫苗庆大霉素残留量检测的方法是有效的。

    2011年12期 v.24 1500-1502页 [查看摘要][在线阅读][下载 150K]
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  • 亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量HPLC检测方法的建立

    田文莉;杨江山;宋庆余;万亚芬;高燕燕;张艳;李小强;

    目的建立亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的HPLC检测方法。方法采用4倍体积甲醇沉淀处理亚单位流感疫苗样品,HPLC色谱条件为:色谱柱:Thermo BioBasic-4 C4柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相:甲醇∶水=80∶20(v/v),流速:1 ml/min,紫外检测器检测波长:275 nm,柱温:33℃,上样量:100μl。并对建立的HPLC法进行验证。结果建立的HPLC法检测壬苯醇醚-9标准品在5~2 500μg/ml浓度范围内线性关系良好;检测壬苯醇醚-9的专属性良好;检测壬苯醇醚-9在灭活流感全病毒提取液和亚单位流感疫苗中的回收率约为100%;检测各浓度壬苯醇醚-9标准品溶液和亚单位流感疫苗的日内和日间精密性均小于3%;检测限和定量限均为5μg/ml。结论建立的HPLC法简便、快速、准确,适用于实验室对亚单位流感疫苗中裂解剂含量的常规检测。

    2011年12期 v.24 1503-1506页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K]
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  • Lipofectamine~ LTX转染Jurkat细胞条件的优化

    牛超;田代印;符州;王莉佳;张明香;

    目的优化阳离子脂质体Lipofectamine誖LTX转染悬浮细胞Jurkat的条件。方法将带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的两种质粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作为基因载体,采用Lipofectamine誖LTX转染Jurkat细胞,绘制细胞生长曲线,检测培养基新鲜度对细胞生长的影响及细胞培养时间、脂质体与质粒DNA的比例、细胞接种密度、不同量培养基等对转染效果的影响,比较瞬时转染效果。结果 Jurkat细胞生长速度与细胞密度密切相关,转染前1 d换液,可保证细胞的良好生长状态,培养基新鲜度对细胞生长影响不大。脂质体体积与质粒质量之比为2.75μl∶500 ng时,其转染效果明显优于其他各组。适当加大转染时Jurkat细胞的铺板密度,可以明显提高转染试剂的利用率。转染48 h后,300μl培养基/孔组的绿色荧光阳性率为600μl培养基/孔组的(1.4±0.2)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。转染后24 h,Lipofectamine誖LTX体积与质粒质量各比例组转染效果差异无统计学意义(P>0.05);转染48 h后,各比例组转染效果差异有统计学意义(P<0.05),且质粒pIRES2-EGFP的转染效果明显优于pIRES2-EGFP-STAT(6P<0.05)。结论优化了Lipofectamine誖LTX转染悬浮细胞Jurkat的条件,为悬浮细胞的转染提供了参考。

    2011年12期 v.24 1507-1510+1517页 [查看摘要][在线阅读][下载 385K]
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综述

  • 环介导等温扩增反应的原理及应用

    黄思佳;解庭波;严家新;

    环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本学者Notomi于2000年在NucleicAcids Res杂志上公开的一种新的基因诊断技术,该法操作简便,扩增效率及灵敏度高,已广泛应用于食品、临床、农业等领域,有望成为主流的基因诊断方法。本文对LAMP的反应特征及原理、优缺点、临床应用作一综述。

    2011年12期 v.24 1511-1513页 [查看摘要][在线阅读][下载 128K]
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  • 表面增强激光解析电离化飞行时间质谱在肿瘤(癌)诊断中的应用

    刘博学;王华阳;曲迅;

    表面增强激光解析电离化飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrome-try,SELDI-TOF-MS)技术具有高通量、快速、高灵敏性的优点,通过差异蛋白质组学研究,将新的标志物单独、联合或结合已知标志物用于肿瘤诊断,具有较高的敏感性和特异性,在肿瘤早期诊断、分级、筛查方面具有良好的应用前景。本文就SELDI-TOF-MS的原理、特性及其在肿瘤诊断中的应用作一综述。

    2011年12期 v.24 1514-1517页 [查看摘要][在线阅读][下载 167K]
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消息