中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

基础研究

  • 二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

    佟敬山;李昌;金宁一;于源华;刘玉生;于芳;胡宁宁;李霄;张钰;

    目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

    2008年03期 169-173页 [查看摘要][在线阅读][下载 315K]
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  • 重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

    雷清;黄思扬;应莲芳;梁凌宇;马亚茹;蒋琳;

    目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

    2008年03期 174-177页 [查看摘要][在线阅读][下载 246K]
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  • 人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

    李金波;朱雷;戚扬;孙杰;王强;苏海滨;迟淑平;程云;

    目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。

    2008年03期 178-180+189页 [查看摘要][在线阅读][下载 141K]
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  • 重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

    屈勇刚;朱光泽;金宁一;孙中锋;于芳;刘玉生;胡宁宁;陆民;夏志平;

    目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。

    2008年03期 181-184页 [查看摘要][在线阅读][下载 189K]
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  • 抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

    尹娜;李鸿钧;彭梅;谢天宏;张光明;施锐;孙茂盛;

    目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

    2008年03期 185-189页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K]
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  • 核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测

    郝小夏;王桂琴;王艳红;李凌霞;郭松佳;兰晶;

    目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。

    2008年03期 190-193页 [查看摘要][在线阅读][下载 248K]
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  • 天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰

    安群星;雷迎峰;穆士杰;张献清;陈蕤;夏爱军;陈晨;易静;吴原茹;徐志凯;

    目的对天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)进行定点突变及聚乙二醇(PEG)修饰,并对修饰产物进行DNA酶活性分析。方法选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83和KR173-174)进行定点突变,将所构建的两个突变体(TCSYFF81-83ACS和TCSKR173-174CG)在大肠杆菌中表达,并纯化表达产物。通过第82位和173位引入的半胱氨酸残基,分别对突变体蛋白进行PEG定点修饰。通过与突变型TCS比较,分析两个PEG修饰型TCS的DNA酶活性。结果突变的TCS经酶切鉴定及测序分析,证明质粒构建正确,表达的目的蛋白相对分子质量约为30000,经PEG修饰后,相对分子质量约为40000。初步分析显示,与突变型TCS相比,所构建的两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA酶活性。结论成功进行了TCS的定点突变及PEG修饰,为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径。

    2008年03期 194-196+203页 [查看摘要][在线阅读][下载 143K]
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  • 三七皂苷R1对铝佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用

    陶里;段金梅;舒晓明;胡凝珠;兰芸;陈阳;白巍;

    目的探索三七皂苷R1对Al(OH)3佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用及降低铝佐剂用量的可行性。方法在甲型肝炎病毒(HAV)抗原中,加入不同剂量的铝佐剂与三七皂苷R1构成复合佐剂,经肌肉注射免疫小鼠,每隔4周检测小鼠血清HAV-IgG水平,并与无佐剂组和单独铝佐剂组进行比较。结果各免疫组抗体水平在12周时达到最高,之后逐渐下降。在抗原中加入复合佐剂后,与无佐剂组相比,IgG水平显著升高;与单独铝佐剂组相比,加入一定剂量的三七皂苷R1能够显著增强铝佐剂的作用,且抗体水平维持时间较长。结论适当剂量的铝佐剂与三七皂苷R1混合作为佐剂,具有增强铝佐剂的作用,并能降低铝佐剂的用量。

    2008年03期 197-200页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K]
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消息

基础研究

  • C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

    韩学波;曾瑾;王玉炯;蔡琴;

    目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

    2008年03期 201-203页 [查看摘要][在线阅读][下载 34K]
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  • 柯萨奇病毒B4对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响

    周密;李凡;

    目的研究柯萨奇病毒B4(CVB4/jlu06株)对ICR小鼠胰腺组织及糖耐量的影响,探讨柯萨奇病毒感染与I型糖尿病(T1D)之间的关系。方法CVB4/jlu06毒株腹腔注射感染ICR小鼠,感染后不同时间取小鼠胰腺组织,进行病理及免疫组化分析,并测定糖耐量。结果随着感染时间延长,小鼠胰腺组织损害加重。免疫组化染色在胰腺组织中检测到大量病毒抗原。感染后117d,病毒感染小鼠糖耐量水平比未感染对照组明显降低,且差异有显著意义。结论CVB4/jlu06毒株感染可引起ICR小鼠糖尿病样症状,其感染可能与T1D的发生密切相关。

    2008年03期 204-206页 [查看摘要][在线阅读][下载 359K]
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预防制品

  • 多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

    何成;蔡蓓蓓;楼觉人;

    目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。

    2008年03期 207-211页 [查看摘要][在线阅读][下载 254K]
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消息

预防制品

  • 禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的制备

    李淑梅;杨帆;汤波;

    目的制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗,并优化其制备工艺。方法采用逆向蒸发法制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗,通过正交试验进行制备条件的优化,用荧光法测定脂质体的包封率。筛选制备高包封率脂质体核酸疫苗的最佳条件,测定脂质体粒径,并对疫苗免疫效果进行检测。结果制备高包封率的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的工艺为:卵磷脂、胆固醇的比例为2∶1(摩尔比),转速为150r/min,温度为45℃,包封率可达80.31%。脂质体粒径平均为149nm,脂质体核酸疫苗显著提高了疫苗的免疫效果。结论按本工艺制备的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗包封率高,脂质体粒径均一,免疫效果良好。

    2008年03期 212-215页 [查看摘要][在线阅读][下载 105K]
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消息

治疗制品

  • 小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化

    饶春明;袁力勇;丁有学;刘兰;李响;郭莹;裴德宁;

    目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。

    2008年03期 216-220+230页 [查看摘要][在线阅读][下载 272K]
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  • 小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植模型大鼠移植区域组织损伤的修复作用

    李秀东;陈玉丙;宋祥福;陈强;张红梅;范洪学;

    目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)注入后在异基因肝移植模型大鼠移植区域的迁徙、定居及组织修复作用,探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法将昆明小鼠肝组织块埋入Wister大鼠肝脏切口,制备异基因肝移植大鼠模型;体外分离、纯化并培养昆明小鼠乳鼠MSCs;经DAPI标记后,尾静脉注入模型大鼠,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在肝脏移植区域的迁徙及定居;采用HE染色观察肝移植区域组织损伤情况。结果MSCs尾静脉注入后,24h即出现在肝移植区域,5d时分布于血管周围,10d时扩散至移植区域血管及周围组织;MSCs治疗5d,HE染色显示移植区域浸润的炎性细胞减少,可见肝组织结构。结论小鼠MSCs可在大鼠体内存活,并参与损伤区血管及组织的修复。

    2008年03期 221-223页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K]
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  • 慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠神经细胞Caspase-3表达及GDNF给药的影响

    李昕华;徐忠信;王晓明;魏爱宣;赵晴;钱佳利;

    目的观察慢性脑缺血后致认知功能障碍大鼠神经细胞半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)表达,并探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠认知功能障碍和Caspase-3表达的影响。方法采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑缺血大鼠模型,随机分为对照组、GDNF组和生理盐水组,分别在术后1月、2月,根据逃避潜伏期对各组大鼠进行记忆功能测定,应用免疫组织化学方法检测Caspase-3表达。结果双侧颈总动脉结扎1、2月组与对照组相比,逃避潜伏期明显延长;GDNF组与生理盐水组比较,逃避潜伏期明显缩短;与对照组相比,缺血组大鼠额叶皮层、海马的Caspase-3阳性细胞数明显增多,与生理盐水组比较,1、2月GDNF组大鼠额叶皮层、海马的Caspase-3阳性细胞数明显减少。结论GDNF可改善认知功能,其机制可能是通过影响Caspase-3凋亡关键蛋白酶表达,抑制神经细胞凋亡。

    2008年03期 224-226页 [查看摘要][在线阅读][下载 70K]
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诊断制品

  • 促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

    陈越;高畅;陈勇;佟立全;孔维;金英花;

    目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。

    2008年03期 227-230页 [查看摘要][在线阅读][下载 186K]
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  • 巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立

    王卓莹;王缦;陈华;陈建;

    目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法,并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针,选择保守序列CMV-pp65设计引物,荧光定量病毒载量;对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试;对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测,并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202~3.6×109copies/ml,敏感性为360copies/ml,CV值在1%左右,特异性高,临床标本检测的符合率为100%。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较,具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高,适用于临床上的病毒检测。

    2008年03期 231-234页 [查看摘要][在线阅读][下载 168K]
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临床观察

  • 黑龙江省肇东县1986和2005年乙型肝炎流行状况比较分析

    张静;

    2008年03期 234页 [查看摘要][在线阅读][下载 10K]
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  • 广州市不同地区10岁以下儿童乙型肝炎疫苗免疫效果评价

    李志群;王鸣;许建雄;梁建华;陈健;冯小娥;

    目的评价广州市不同地区10岁以下儿童乙型肝炎疫苗免疫效果。方法对本市老城区、新城区和农村1995~2005年出生、接受乙型肝炎疫苗全程免疫的儿童,按分层随机抽样3890人,检测其HBsAg和抗-HBs水平,并计算阳性率。结果1995~2005年,三地区出生的儿童HBsAg阳性率逐年下降,抗-HBs阳性率逐年上升;老城区HBsAg阳性率比新城区和农村明显下降,老城区和新城区抗-HBs阳性率比农村明显上升;三地区10、5、0岁儿童HBsAg阳性率依次下降,抗-HBs阳性率依次上升。结论广州市10岁以下儿童乙肝疫苗免疫保持在高水平,农村的乙肝疫苗免疫效果较老城区和新城区偏低,可能是造成乙型肝炎发病率高的主要原因之一。

    2008年03期 235-236页 [查看摘要][在线阅读][下载 26K]
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实验技术

  • 乳酸菌质粒提取方法的建立

    马海利;金宁一;李昌;杜桢;阚秋霞;陈晓月;

    目的建立简便、快速、安全的乳酸菌质粒提取方法。方法将文献报道的乳酸菌质粒提取方法和大肠杆菌质粒提取方法相结合,建立乳酸菌质粒提取方法。通过方法比较、溶菌酶浓度优化和酶切分析,验证该方法的可行性。结果用所建立的方法提取的乳酸菌质粒电泳与酶切图谱与文献报道的提取方法相比均无明显差异。溶菌酶最佳浓度为10mg/ml,避免了毒性物质溴化乙锭的应用,减少了溶菌酶的用量和溶液体积。结论所建立的方法可用于乳酸菌质粒的快速提取,为乳酸菌分子生物学研究奠定了基础。

    2008年03期 237-239+247页 [查看摘要][在线阅读][下载 169K]
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  • 人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

    高荣;高英杰;赵建增;罗胜军;温涛;

    目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCG单克隆抗体,以一种包被微孔板制成固相抗体,另一种标记碱性磷酸酶,以金刚烷衍生物为底物,采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度,并与进口试剂进行比较。结果以5μg/ml单克隆抗体包被微孔板,酶结合物以1∶10000稀释,在室温条件下检测,可测范围为5~540mIU/ml,灵敏度为0.143mIU/ml,批内、批间平均变异系数分别为5.28%和7.05%,平均回收率为98.77%,范围为92.3%~108.6%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0.01%。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。

    2008年03期 240-243页 [查看摘要][在线阅读][下载 106K]
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消息

综述

  • 杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因分型技术的研究进展

    陈士华;周海鸥;

    杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是调节NK细胞功能的重要受体,其基因家族具有高度多态性,KIR基因分型对于阐明其功能作用具有重要的意义。本文综述了近年来杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因分型等位基因的鉴定及其应用,如单倍型组合分析等方面的研究进展。

    2008年03期 244-247页 [查看摘要][在线阅读][下载 51K]
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  • 百日咳基因工程疫苗的研究进展

    章金勇;张晓丽;邹全明;

    近年来,随着基因组学和生物技术的迅猛发展,对百日咳主要毒力因子和抗原成分的结构及功能有了更加深入的了解,为开发新一代百日咳基因工程疫苗奠定了基础。本文对百日咳基因工程疫苗,包括亚单位疫苗、DNA疫苗及百日咳杆菌的免疫机制的研究进展作简要综述。

    2008年03期 248-250+256页 [查看摘要][在线阅读][下载 53K]
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  • 真菌多药耐药相关的外排蛋白基因研究进展

    王爽;王丽;

    真菌的多药耐药现象日益严重,受到人们广泛重视。外排蛋白表达增强,导致细胞内药物浓度降低是产生多药耐药的重要机制。本文就外排蛋白分类、结构、功能、相关基因及其调控因子的研究进展作一综述。

    2008年03期 251-253页 [查看摘要][在线阅读][下载 42K]
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  • 结肠癌干细胞的研究进展

    周瑞莲;姚程;陈玉丙;

    肿瘤干细胞对于肿瘤发生发展的研究将会产生很大影响,肿瘤治疗也必将以肿瘤干细胞为重要的靶标来设计方案。本文对结肠癌干细胞的分离方法与信号传导的相关性及结肠癌干细胞的研究进展作一简要综述。

    2008年03期 254-256页 [查看摘要][在线阅读][下载 38K]
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