中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

基础研究

  • 人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

    李晓琳;孟明耀;刘建生;李琦涵;侯宗柳;

    目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。

    2008年02期 81-84页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K]
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  • 可溶性血管内皮生长因子受体2片段的表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

    李然伟;刘禄成;李哲;王颂;高瑞娟;

    目的探讨可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)抑制血管内皮细胞增殖及在血管生成中的作用。方法提取脐静脉内皮细胞(HUVEC)总RNA,扩增KDR基因膜外1~4结构域,构建原核表达载体pQE40-KDR,转化E.coli M15,经IPTG诱导表达,镍离子柱亲和层析纯化后复性,用Western blot检测sKDR蛋白的表达,MTT比色法和鸡胚尿囊膜(CAM)试验分别检测其对HUVEC增殖的影响及其对血管生成的作用。结果经RT-PCR扩增得到了1150 bp左右的sKDR片段,并在pQE40原核表达系统中表达了sKDR蛋白,以包涵体形式存在。纯化后蛋白电泳呈现相对分子质量50000左右的单一条带,纯化蛋白占总蛋白的98%,蛋白含量为80μg/ml。Western blot证实其为重组sKDR蛋白。MTT检测结果显示,sKDR可抑制血管内皮生长因子(VEGF)刺激的HUVEC增殖,并阻滞VEGF诱导的CAM血管增生。结论已成功构建sKDR原核表达载体,并在大肠杆菌M15中获得表达,纯化的sKDR片段具有与VEGF结合的生物学功能,有望成为基因治疗肿瘤血管形成的理想靶点。

    2008年02期 85-89页 [查看摘要][在线阅读][下载 278K]
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消息

基础研究

  • NA-1株鹅源副粘病毒M、F和HN蛋白基因的真核表达

    马爱霞;袁洁;丁壮;宣华;宋子运;徐明;

    目的获得鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株M、F和HN基因真核表达蛋白。方法将NA-1株GPMV经SPF鸡胚增殖、纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank登录的NA-1株GPMV基因组序列,设计3对特异性引物,利用RT-PCR法,分别扩增M、F和HN基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至pMD18-T-Simple载体,并进行酶切和序列测定。将目的片段克隆至pCI-neo表达载体,酶切鉴定正确的重组质粒,分别命名为pCI-M、pCI-F和pCI-HN。将重组表达质粒分别转染Vero细胞,用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达。结果RT-PCR法分别扩增出M、F和HN基因,大小与预期一致。克隆载体及表达载体酶切及测序鉴定正确;重组真核表达质粒转染Vero细胞后,荧光显微镜下可见特异性荧光。结论利用pCI-neo真核表达载体在Vero细胞中成功表达了NA-1株GPMV M、F和HN基因,为下一步研究该病毒的出芽机制以及各结构蛋白的功能奠定了基础。

    2008年02期 90-92+98页 [查看摘要][在线阅读][下载 184K]
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  • 沙蚕消化道细菌D2胞外蛋白酶的分离纯化及其性质

    代玉梅;闫志勇;王斌;钱冬萌;宋旭霞;丁守怡;刘明军;张艳丽;

    目的分离纯化沙蚕消化道菌D2胞外蛋白酶,并对其性质进行分析。方法收集48 h发酵液上清,经80%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Superdex G-75凝胶过滤层析逐步纯化D2蛋白酶,分析其酶学性质,并用ESI-MS/MS测定其酶解后的部分氨基酸序列。结果经纯化,得到电泳纯的D2蛋白酶,纯化倍数为4.9倍,活性回收率为33%,相对分子质量约42 000,纯度大于99%;最适作用温度为60℃,最适pH为9,在pH6~11及0~60℃具有较好的稳定性,水解酪蛋白的Km值为2.44 mg/ml;Cu2+、Ca2+、Mg2+、K+等金属离子对酶活力有明显促进作用,EDTA和PMSF对酶活力有强烈抑制作用;该酶对尿素、SDS、DTT等变性剂有较好的耐受性,其两个内部肽段经质谱测序,序列分别为AHGFLPLTK和APSATG-GSALYPLEFVVGK。结论该酶为一高温碱性丝氨酸蛋白酶,具有较高的工业开发价值和较大的应用潜力。

    2008年02期 93-98页 [查看摘要][在线阅读][下载 560K]
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  • 尾加压素Ⅱ对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响

    田琳;李才;赵岩;于晓艳;苗春生;

    目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞增殖和细胞周期的影响及其机制。方法在NRK-52E细胞培养液中加入10-10、10-9、10-8和10-7mol/L UⅡ,同时设UⅡ活性阻断组:UⅡ+尼卡地平和UⅡ+EDTA,以单纯DMEM为对照组。培养48 h后,采用5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。结果UⅡ(10-10~10-8mol/L)以浓度依赖方式促进NRK-52E细胞BrdU掺入(A值分别为0.491±0.038、0.291±0.024和0.281±0.037),其中以10-8mol/L UⅡ的作用最明显,10-7mol/L UⅡ对NRK-52E细胞增殖的影响与对照组比较差异无显著意义。UⅡ影响NRK-52E细胞周期,在10-10~10-8mol/L浓度范围内增加S期细胞百分比(分别为26.96%±3.35%、44.26%±3.28%、48.12%±2.22%)。尼卡地平和EDTA均可以降低UⅡ诱导NRK-52E细胞的BrdU掺入增加,降低S期细胞百分比。结论UⅡ具有较强促进NRK-52E细胞增殖的作用,但大剂量则无此作用,其诱导NRK-52E细胞增殖作用部分是通过Ca2+内流来介导的。

    2008年02期 99-102页 [查看摘要][在线阅读][下载 183K]
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  • [VEGF]hTERT复合调控序列介导HSV-tk自杀基因诱导肿瘤细胞的凋亡

    崔文璟;潘风光;刘燕玲;张玉静;

    目的构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)核心启动子及血管内皮生长因子(VEGF)增强子复合调控序列的真核表达载体,并检测在复合调控序列调控下HSV-tk自杀基因对肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法构建复合调控序列[VEGF]hTERT和胸苷激酶(tk)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和PCMV启动子的真核对照表达载体pcDNA3.1(+)-tk,转染肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选抗性克隆,给入前药丙氧鸟苷(GCV),MTT比色法测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果质粒pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和pcDNA3.1(+)-tk经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。转染了带有不同启动子的真核表达载体的肿瘤细胞,在给入前药GCV后均能表现出对细胞生长的抑制作用,GCV对A549细胞的抑制率大于SMMC-7721细胞,并能引起肿瘤细胞凋亡。[VEGF]hTERT在A549细胞中的活性较在SMMC-7721中高。结论HSV-tk自杀基因在肿瘤细胞内瞬时表达即能引起靶细胞凋亡,且复合调控序列在肿瘤细胞中的活性较通用真核细胞转录启动子PCMV高,为深入进行自杀基因治疗的研究提供了一定理论依据。

    2008年02期 103-106页 [查看摘要][在线阅读][下载 360K]
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  • Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

    谢庆军;范凌云;李季风;胡晓燕;

    目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。

    2008年02期 107-110+118页 [查看摘要][在线阅读][下载 191K]
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  • 汉坦病毒SEO型S基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

    袁子国;张秀香;李修明;张守峰;徐慧娟;高胜岩;王晓虎;扈荣良;

    目的构建汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒SEO型的YZG-Changchun株S基因,克隆至pMD18-T载体中,经酶切鉴定及PCR分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coliRosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达情况。结果表达载体经双酶切和测序证明构建正确。IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4.5 h时,S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,纯化后的蛋白具有良好的抗原活性。结论已成功构建了汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体,并得到高效表达。

    2008年02期 111-114页 [查看摘要][在线阅读][下载 224K]
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  • 绿色荧光蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

    陈晓月;金宁一;海洋;邹伟;马海利;李昌;

    目的探讨异源基因在枯草芽孢杆菌中表达的可行性。方法以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭质粒为基本骨架,在大肠杆菌中完成含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达质粒的构建,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,采用电转化的方法,将重组质粒转入枯草芽孢杆菌进行表达,通过检测GFP的存在,评价枯草芽孢杆菌对异源基因的表达。结果重组表达质粒pGJP-GFP酶切鉴定结果与预期片段大小相符。绿色荧光蛋白可在枯草芽孢杆菌中表达,且表达蛋白具有较好的生物学活性。结论利用枯草芽孢杆菌的自身启动子,可以实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达。

    2008年02期 115-118页 [查看摘要][在线阅读][下载 174K]
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  • 乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

    高正伦;盛军;刘丹;刘晓宇;李娟;郝淑美;吉海滨;刘建华;

    目的提高乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV(U1株)翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。

    2008年02期 119-122+130页 [查看摘要][在线阅读][下载 251K]
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  • 梅花鹿鹿茸干组织裸鼠皮下移植动物模型的建立

    邓扬;刘殿峰;

    目的建立梅花鹿鹿茸干组织异种移植动物模型,并观察原始鹿茸干组织在异体继续生长和发育情况。方法将梅花鹿鹿龄为1周岁的初生鹿茸干组织(对照组用前额骨膜)移植到裸鼠头部皮下,观察移植物的生长情况。于移植后60 d切取移植物,同时提取移植物组织的RNA,以cDNA为模板,采用梅花鹿的X型胶原(ColX)的特异性引物进行PCR,检测移植物来源,并进行序列分析。结果实验组受鼠头部均观察到移植物的生长,移植后60 d,移植物平均直径可达8.03 mm,高度可达15.67 mm。PCR产物可见约200 bp的特异条带,测序结果与已报道的梅花鹿的ColX基因的mRNA序列同源性为100%。结论鹿茸干组织移植到裸鼠头部能够继续生长发育,裸鼠可作为研究鹿茸干组织再生发育规律及其调控机制的动物模型。

    2008年02期 123-125页 [查看摘要][在线阅读][下载 59K]
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  • 应用统计分析和化学动力学参数评价生物制品的稳定性

    朱征宇;汪恩浩;王媛;

    目的应用统计分析和化学动力学参数评价生物制品的稳定性。方法以重组乙型肝炎疫苗为例,拟合其效力随时间衰减的回归直线,由其95%置信曲线预测制品的有效期。根据阿伦尼乌斯方程,从较高温度下效力衰减的速率常数估算较低温度下的速率常数。由衰减速率常数计算制品的半衰期,并用于稳定性评估。结果通过对稳定性数据的统计分析能预测有效期和失活速率常数等化学动力学参数能有效地反映制品稳定性的变化。结论应用统计分析和化学动力学参数研究生物制品的稳定性,可以在设定的置信区间下预测制品的有效期,缩短临床前稳定性研究所需的时间,并对生产变更可能导致的稳定性变化进行可靠的评估。

    2008年02期 126-130页 [查看摘要][在线阅读][下载 250K]
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预防制品

  • 复制型重组痘苗活载体疫苗生产工艺研究

    王宁;刘颖;李媛媛;罗兰;侯秀霞;刘建源;

    目的研究复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。方法通过在病毒-细胞比(MOI)、不同培养时间、培养温度、碳酸氢钠含量的条件下培养复制型重组痘苗病毒,确定适用于重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。以确定的生产工艺制备3批疫苗,并进行各项检定。结果以MOI为1∶750,培养液中加入7.5%碳酸氢钠的比例为1.0%,培养温度为37℃,培养时间为72 h左右,获得疫苗的病毒滴度最高。按此生产工艺生产的3批疫苗,病毒滴度均在107PFU/ml以上,经检定各项指标均合格。结论确定了复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。

    2008年02期 131-132+138页 [查看摘要][在线阅读][下载 64K]
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  • 甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达

    张艳;赵大鹏;戚凤春;汪春义;张雪梅;范洪学;王坤;

    目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。

    2008年02期 133-135页 [查看摘要][在线阅读][下载 111K]
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治疗制品

  • 重组人促红素体内、体外生物学活性差异成因分析

    周勇;王箐舟;肖林;杨鹏云;黄培堂;王军志;

    目的分析造成重组人促红素(rHuEPO)体内、体外生物学活性差异的原因。方法按《中国药典》三部(2005版)方法检测rHuEPO样品体内、体外生物学活性,并通过等电聚焦电泳分析、唾液酸含量、纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测,探讨样品体内、体外生物学活性产生差异的原因。结果体内、体外生物学活性有差异的rHuEPO样品中,存在糖链末端N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO成分。纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测结果未见异常。结论为提高rHuEPO产品质量,应在生产过程中有效去除N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO。

    2008年02期 136-138页 [查看摘要][在线阅读][下载 190K]
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临床观察

  • 2005和2006年流感裂解疫苗接种人体后的反应及免疫效果

    柴文清;鲁芳;陈翠花;夏小凯;储艳;王树巧;

    目的观察2005、2006年变更流感毒株后制备的裂解疫苗接种人体后反应及免疫效果。方法变更毒株的流感裂解疫苗于2005和2006年,分别在江西九江和河南漯河进行了接种人体后反应及免疫效果观察。结果2年的观察结果显示,生产的流感裂解疫苗接种人体后全身、局部反应轻微,并有较好的抗体应答,对有流感抗体者接种流感疫苗后,仍能促使机体产生高效抗体。结论用变更毒株生产的流感病毒裂解疫苗接种人体后反应和免疫效果均良好。

    2008年02期 139-142页 [查看摘要][在线阅读][下载 43K]
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实验技术

  • SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备

    孟淑芳;林林;冯建平;李修兰;王佑春;李德富;

    目的建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证。方法通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株。分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法。并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40。结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间最早,病变最明显,产毒量最高。SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响。病毒的最佳吸附时间为120 min。接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度最高,平均为8.81 lg CCID50/ml。结论已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础。

    2008年02期 143-146页 [查看摘要][在线阅读][下载 284K]
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  • 超高压用于病毒减毒及灭活的研究

    周密;李凡;郑贤红;张守勤;

    目的采用超高压的方法处理流感病毒FM1株和柯萨奇病毒B3(CVB3/MKP),并确定最适灭活条件。方法以不同的压力和时间处理FM1和CVB3/MKP病毒,并检测处理后病毒毒力及对ICR小鼠的感染性。结果FM1和CVB3/MKP病毒的灭活条件分别为300 MPa,2.5 h和700 MPa,0.5 h。感染小鼠组织病理切片显示,超高压组小鼠的肺和心肌组织有少量炎细胞浸润,接近正常肺组织。超高压处理FM1组小鼠的肺指数与病毒对照组比较,差异有显著意义。结论超高压的方法可用于流感病毒FM1株和柯萨奇病毒B3(CVB3/MKP)的减毒或灭活。

    2008年02期 147-149页 [查看摘要][在线阅读][下载 33K]
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  • 重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

    殷玉和;高冷;吴丛梅;李东风;

    目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。

    2008年02期 150-152页 [查看摘要][在线阅读][下载 162K]
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综述

  • 腺病毒载体的研究进展

    范凌云;谢庆军;

    目的由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,并广泛应用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在一些不足,如具有一定的免疫原性和毒性等,尚有待进一步解决。随着腺病毒载体研究的进展,新的载体系统必将在基因治疗中发挥更重要的作用。本文对腺病毒载体的研究进展作一综述。

    2008年02期 153-157页 [查看摘要][在线阅读][下载 55K]
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  • 人巨细胞病毒感染及作用机制研究

    张冬娜;赵军;薛立娟;张文岚;

    人巨细胞病毒(HCMV)在人群中具有普遍感染性,其在免疫抑制患者中常诱发疾病,并引起严重后果。近年来,随着研究的不断深入,对HCMV引起的机体损伤及感染、致病机制都有了进一步认识。本文仅就HCMV感染对机体的影响及其与宿主细胞相互作用的可能机制进行综述。

    2008年02期 158-161页 [查看摘要][在线阅读][下载 48K]
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  • 疏水色谱法在蛋白复性方面的应用

    王素红;韩金祥;王世立;

    疏水色谱与蛋白作用温和,适用于活性蛋白的分离及复性,是色谱复性中应用较多的方法。本文对疏水色谱法的保留机制、疏水固定相中柱型、无机填料、有机填料、均一孔填料的发展以及疏水色谱法在蛋白纯化和复性方面的应用作一综述。

    2008年02期 162-165页 [查看摘要][在线阅读][下载 45K]
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  • 狂犬病病毒抗原的体外检测方法

    张国强;王远征;

    目的狂犬病毒抗原含量是狂犬病疫苗的主要质量指标之一,疫苗的研制过程中常需要及时进行抗原的检测。准确、简便的测定方法可以大大提高工作效率,同时也为狂犬病疫苗精制方法和工艺的筛选、确定及优化提供依据。合适的检测方法也可为临床诊断狂犬病提供方便。本文简要综述几种有关狂犬病毒抗原的检测方法。

    2008年02期 166-168页 [查看摘要][在线阅读][下载 31K]
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