中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

基础研究

  • 幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

    袁小澎;邹全明;柏杨;张卫军;郭刚;谢庆华;刘开云;吴超;

    目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。

    2007年07期 473-477页 [查看摘要][在线阅读][下载 514K]
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  • 重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用

    史宇晖;李永华;闫玲;李彤;李杰;王玲;庄辉;

    目的在大肠杆菌中表达重组SARS-CoVN蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础。方法通过RT-PCR获得SARS-CoVN蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒。转化E·coliM15,IPIG诱导表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平。结果所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白。该蛋白纯化后,纯度可达90%左右。Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应。免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清。结论重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断。

    2007年07期 478-481页 [查看摘要][在线阅读][下载 427K]
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  • 非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

    何春艳;唐丽丽;李嘉;韩玉英;吴书军;周琳婷;应通锋;秦洁;

    目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。

    2007年07期 482-485+492页 [查看摘要][在线阅读][下载 557K]
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  • 流感疫苗诱导Hela细胞凋亡与免疫调节效应

    杨巍;王宇峰;蒋颖超;杨林;常雅萍;

    目的观察流感疫苗诱导Hela细胞凋亡与免疫调节效应。方法将流感疫苗作用于Hela细胞,采用MTT比色法和流式细胞仪检测疫苗对Hela细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;同时用MTT法检测疫苗对小鼠脾细胞增殖的影响;采用结晶紫、中性红染色及MTT法,分别检测脾细胞诱导上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌情况。结果一定浓度流感疫苗能够抑制Hela细胞增殖,促进细胞凋亡,凋亡率可达58·37%;还可促进小鼠脾细胞增殖及Th1型细胞分泌IFN-γ。结论流感疫苗能够抑制Hela细胞增殖,此作用可能是通过诱导Hela细胞凋亡、调节免疫细胞增殖及IFN-γ的分泌而实现的。

    2007年07期 486-488页 [查看摘要][在线阅读][下载 271K]
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  • 口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

    任林柱;孙大辉;王兴龙;刘锴;王学理;张辉;

    目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%~94·23%、84·91%~96·66%和66·98%~82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%~99·39%和91·84%~98·55%,WFL株P3基因的第1150~1270、1680~1840和2080~2490bp以及2C基因的第354~470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。

    2007年07期 489-492页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K]
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  • 沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质

    代玉梅;闫志勇;王斌;钱冬萌;宋旭霞;丁守怡;刘明军;张艳丽;

    目的从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选产蛋白酶菌株,并对其胞外蛋白酶的性质进行分析。方法用脱脂奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶菌株的筛选和蛋白酶活力测定;Bradford法测定蛋白含量;UVP GDS8000型凝胶成像系统和VisionWorks、Bandscan4·03软件进行相对分子质量和纯度分析,并对酶的各项性质进行检测。结果筛选出高蛋白水解活性菌株D2,其胞外蛋白酶比活性为156·0U/mg,相对分子质量约为42000,纯度大于97%,最适作用温度60℃,最适pH为9,在pH6~10及0~55℃具有较好的稳定性。结论D2株分泌的胞外蛋白酶有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。

    2007年07期 493-496页 [查看摘要][在线阅读][下载 221K]
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  • GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定

    高碧峰;王宗仁;卓鹏展;张德安;肖茜;

    目的利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定。方法IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符。Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的结构和功能奠定了基础。

    2007年07期 497-499页 [查看摘要][在线阅读][下载 362K]
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  • 流行性乙型脑炎病毒在二倍体细胞上的适应性

    王辉;张月兰;张颖;张晋;杨阳;张占银;罗书荣;钟书声;

    目的研究流行性乙型脑炎病毒在二倍体(2BS)细胞上的传代适应性,确定在2BS细胞上培养乙脑病毒的条件和方法。方法通过病毒毒力和免疫原性检测,观察在不同培养条件下乙脑病毒在2BS细胞上的增殖情况。结果pH值在7·4~7·6之间、人血白蛋白含量为0·2%、病毒稀释度为1:1000时,病毒维持液培养的病毒滴度最高。在2BS细胞上传50代的病毒滴度均在7·0logLD50以上,且差异无显著意义。连续传代后病毒的免疫原性下降。结论建议用于建立病毒种子库的流行性乙型脑炎病毒,在2BS细胞上传代不应超过3代。

    2007年07期 500-502页 [查看摘要][在线阅读][下载 93K]
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预防制品

  • 人用H5N1禽流感裂解疫苗的制备工艺

    朱智勇;丁晓航;朱函坪;李岩金;陈学奎;沈吉友;张涛;何培江;姚苹苹;徐芳;翁景清;谢荣辉;赵芝雅;龚华岳;郭志宏;苏波;孙淑滨;梁伟峰;

    目的设计3种工艺,制备不同裂解程度的禽流感疫苗,并观察其免疫效果。方法用禽流感毒种R1203株制备3种禽流感疫苗(全病毒、裂解-1和裂解-2),并分别以不同剂量免疫大鼠和家兔,肌肉接种2针(间隔14d),初免后14d和28d静脉采血,检测动物血清中血凝抑制抗体和中和抗体。结果两种动物在疫苗接种1针后14d,血抑抗体和中和抗体滴度均较低;接种2针后14d,均显著高于1针;裂解-2疫苗接种两种动物后的抗体反应均高于其他两种疫苗,且家兔的中和抗体量-效反应明显。结论裂解-2疫苗的工艺优于其他两种疫苗,其中和抗体能正确反映疫苗的质量。

    2007年07期 503-506页 [查看摘要][在线阅读][下载 439K]
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  • 水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

    庞宇;刘建源;李秀玲;赵广荣;

    目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2~3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。

    2007年07期 507-509页 [查看摘要][在线阅读][下载 95K]
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  • 甲乙型肝炎联合疫苗的稳定性

    马波;练幼辉;谭顺革;阳选祥;代云波;王馨;张发武;赵琼英;

    目的观察甲乙型肝炎联合疫苗的稳定性。方法将甲乙型肝炎抗原不同浓度比例配制的联合疫苗,于4℃保存不同时间后,免疫ICR小鼠,观察该联合疫苗的稳定性。结果在未加任何保护剂的情况下,置4℃保存2年,其抗体效价基本维持原有水平。结论甲乙型肝炎抗原不同浓度比例配制的联合疫苗具有良好的稳定性。

    2007年07期 510+530页 [查看摘要][在线阅读][下载 62K]
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治疗制品

  • 猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化

    王云龙;李玲玲;李晨阳;吴阳;

    目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。

    2007年07期 511-514页 [查看摘要][在线阅读][下载 409K]
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  • 重组人尿激酶原质控方法和质量标准的研究

    丁有学;李响;韩春梅;饶春明;王军志;

    目的建立重组人尿激酶原的质控方法和质量标准。方法以纤维蛋白平板法测定重组人尿激酶原的生物学活性,S-2444发色底物法测定单双链比例,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和分子筛色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于重组人尿激酶原产品的常规检定。

    2007年07期 515-518页 [查看摘要][在线阅读][下载 261K]
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实验技术

  • 重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

    应莲芳;梁凌宇;杨军;高雪峰;蒋琳;

    目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。

    2007年07期 519-521页 [查看摘要][在线阅读][下载 276K]
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  • 人乳头瘤病毒16型L1蛋白的纯化及免疫学活性

    安静;周旭;席亮;包红;陈汉泉;

    目的纯化人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白,并分析其免疫学活性,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。方法采用电洗脱的方法纯化目的蛋白,通过免疫双扩散和ELISA法检测其免疫反应性。将该蛋白免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性。结果纯化后的目的蛋白经凝胶灰度扫描显示,其纯度达到95%,免疫双扩散和ELISA结果显示,宫颈癌病人血清抗体效价明显高于健康人,表明该蛋白具有良好的抗原性,小鼠免疫力试验结果表明该蛋白具有较好的免疫原性。结论电洗脱法得到的目的蛋白纯度较高,且有较好的免疫学活性。

    2007年07期 522-524页 [查看摘要][在线阅读][下载 276K]
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  • 酶标法测定干扰素脂质体的包封率

    张水华;李云富;张雪涛;易艳蓉;杨虹;王妍;

    目的应用酶标法检测干扰素脂质体包封率。方法应用ELISA法测定干扰素脂质体裂解前后的干扰素含量,计算脂质体的包封率,并与传统的Wish细胞病毒抑制法比较。结果ELISA法在干扰素活性为104~107IU/ml范围内,能检出的结果精密度明显高于传统Wish细胞病毒抑制法。Wish细胞病毒抑制法测定的3批样品包封率的CV值分别为8·6%、11·2%和12·70%,ELISA法测定的CV值分别为3·1%、4·3%和4·7%,二者差异有显著意义。结论ELISA法可以快速、高通量、准确地检测干扰素脂质体的包封率。

    2007年07期 525-527页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K]
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  • 葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

    何小曼;张超;杨文冲;童军;刘颖;王丹;栾勇;王玮欣;王超;

    目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000~180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。

    2007年07期 528-530页 [查看摘要][在线阅读][下载 314K]
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  • 实现自控分离对人血浆蛋白质量的影响

    张安山;周海云;郭广兆;张继鹏;韩国德;杨晓东;王剑霓;杨庆梅;何彦林;

    目的对低温乙醇血浆蛋白分离工艺实现自控后分离的人血浆蛋白各项质量指标和收获率进行评价。方法按照《中国药典》三部(2005版)规定的方法和标准,对低温乙醇工艺实现自控后分离的人血浆蛋白样品各项指标进行测定,并将测定结果与自控前的制品进行比较。结果连续测定实现自控后分离的71批人血白蛋白和52批静注人免疫球蛋白(IVIG)样品,并与实现自控前的82批人血白蛋白、29批静注人免疫球蛋白(IVIG)成品检定结果进行比较,发现人血白蛋白及IVIG的纯度和收获率均有明显提高,多聚体含量明显下降,其他指标(离子含量、吸光度等)均无明显改变,且制品质量稳定,符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论低温乙醇分离蛋白实现自控后,进一步提高了人血浆蛋白的质量,使分离过程更加容易控制,制品质量更加趋于稳定。

    2007年07期 531-533页 [查看摘要][在线阅读][下载 289K]
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  • 富铬啤酒酵母发酵过程中最适Cr~(3+)浓度及加入方法

    刘晓铭;廖艳红;钟双辉;邓君玲;谢小莉;吕加平;李侍武;

    目的优化富铬啤酒酵母发酵过程中Cr3+浓度及加入方法。方法在富铬啤酒酵母发酵过程中,分别加入0·05、0·10、0·15、0·20、0·25、0·30和0·40g/L的Cr3+浓度,并比较一次性加入法与连续加入法的细胞内总铬、生物活性铬、菌体密度以及菌体湿重。结果Cr3+最适浓度为0·20~0·25g/L,采用连续加入法,30h后细胞湿重可达52·32g/L发酵液,生物活性铬可达315·34μg/g干细胞,细胞内总铬可达605·46μg/g干细胞,生物活性铬占细胞内总铬的52·1%,均优于一次加入法。结论确定了富铬啤酒酵母发酵过程中适宜的Cr3+浓度及加入方法,为优化富铬啤酒酵母发酵工艺奠定了基础。

    2007年07期 534-535+542页 [查看摘要][在线阅读][下载 161K]
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  • 改进的蒽酮法检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中多糖浓度

    吴凯;代泽友;马波;周燕美;吴绍学;樊会兰;黄镇;

    目的改进检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中多糖浓度的蒽酮法。方法分别对蒽酮法中蒽酮的浓度和处理温度进行优化,并对改进的方法进行验证和重复性检测。结果适宜的蒽酮浓度为0·3g/300ml,处理温度为40℃,在检测肺炎链球菌多糖结合物原液中的多糖浓度时,标准曲线回归系数高,方法稳定,重现性好。结论改进的蒽酮法可以有效、准确、稳定地检测肺炎链球菌结合物多糖原液中的多糖浓度。

    2007年07期 536-538+549页 [查看摘要][在线阅读][下载 161K]
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综述

  • 抗菌肽生物活性及其影响因素的研究进展

    程福亮;韩文瑜;雷连成;

    抗菌肽是基因编码、核糖体合成的小分子活性肽,不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞具有杀伤活性,还具有抗感染、免疫调节、信号转导等生物学功能。然而,自身和外在的一些因素影响了抗菌肽的生物学活性,并在一定程度上制约了其临床应用。当前研究从抗菌肽自身结构及其与受体间的相互作用等方面入手,以期降低影响因素的不利水平,提高抗菌肽的生物学活性。本文就抗菌肽生物活性及其影响因素的研究进展作一综述。

    2007年07期 539-542页 [查看摘要][在线阅读][下载 156K]
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  • 无机纳米佐剂研究进展

    梁存军;黎晓敏;吕凤林;王健;

    纳米材料因具有连接宏观与微观的桥梁作用而倍受瞩目,在医学领域的应用较广泛,且具有广阔的应用前景。本文概述了纳米载体材料的结构特性、制备方法、分析表征方法以及无机纳米材料氢氧化铝和磷酸钙作为免疫佐剂的应用。

    2007年07期 543-546页 [查看摘要][在线阅读][下载 120K]
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  • 白细胞介素-18在DNA疫苗免疫中的佐剂效应

    葛金玲;贺冰;

    白细胞介素-18(IL-18)作为分子佐剂,可促进DNA疫苗的免疫效应。本文就近年来IL-18作为分子佐剂,应用于多种感染性疾病和肿瘤DNA疫苗的免疫研究进展作一综述。

    2007年07期 547-549页 [查看摘要][在线阅读][下载 106K]
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  • 肝细胞相关生物活性肽的研究进展

    傅颖;

    肝细胞刺激因子、肝细胞生长因子和肝再生增强因子是一类能促进人类及动物细胞再生、促进细胞进行有丝分裂和生长、促进组织器官损伤后的修复、治疗肝衰竭和促进肝再生,又具有各自独特功能的生物活性小分子物质。本文主要介绍了与肝细胞相关的3种生物活性肽的功能及作用机制的研究进展。

    2007年07期 550-552页 [查看摘要][在线阅读][下载 104K]
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