中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

基础研究

  • 睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

    毕华;袁力勇;史新昌;李永红;赵阳;饶春明;王军志;

    目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。

    2007年05期 313-317页 [查看摘要][在线阅读][下载 655K]
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  • 重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定

    马涛;李鼎锋;傅晶晶;李亮助;孙茂盛;刘勇;邵一鸣;

    目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。

    2007年05期 318-321页 [查看摘要][在线阅读][下载 543K]
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  • 进化免疫球蛋白结合分子LD5的原核表达、纯化及结合活性

    蒋少华;徐容;何俊;陈璐;卢海妹;贾建安;陈秋莉;潘卫;

    目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。以ELISA和Dot blot对LD5蛋白结合IgG、IgM活性进行鉴定。结果LD5分子在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白相对分子质量为59000。Western blot表明纯化的LD5蛋白能特异结合IgG。ELISA结果显示,LD5在结合IgM上较SpA具有明显的优势。结论LD5分子在大肠杆菌中已成功表达,纯化的LD5蛋白保留了天然Ig结合分子的结合活性。

    2007年05期 322-326页 [查看摘要][在线阅读][下载 470K]
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  • 新型抗病毒蛋白2CVN融合基因的构建、表达与纯化

    刘玉生;金宁一;李昌;于芳;佟敬山;胡宁宁;金洪涛;李臻;

    目的构建新型抗病毒蛋白2CVN融合基因,增强CVN对病毒的结合性及中和活性,为进一步研究抗病毒药物奠定基础。方法采用PCR法,以pBluescriptⅡSK(+)-CVN质粒为模板,扩增CVN片段,在引物中引入Linker序列,将扩增的CVN片段与载体pET-CVN连接,构建pET-2CVN原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达及产物纯化。结果表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,相对分子质量为29000,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的31.48%,纯化后的目的蛋白纯度达95%以上。结论已成功构建了2CVN融合基因,并获得高效表达。

    2007年05期 327-329页 [查看摘要][在线阅读][下载 336K]
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  • 含HPV16型反义E7基因的重组腺相关病毒rAAV-HPV16E7AS的包装、纯化及鉴定

    邬素芳;易诚青;李静;李辅军;卢运萍;马丁;

    目的利用重组腺相关病毒载体系统,包装含HPV16型反义E7基因重组腺相关病毒rAAV-HPV16E7AS,并进行纯化及鉴定。方法利用磷酸钙沉淀法,将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞293细胞中,分别合成rAAV-HPV16E7AS和rAAV-lacZ,用斑点杂交法测定重组病毒的滴度,并用重组病毒感染293细胞测定其转染效率。结果所构建的rAAV-HPV16E7AS和rAAV-lacZ滴度均为1.0×1010个病毒分子/ml,平均转染效率为75%。结论已成功构建rAAV-HPV16E7AS,为临床预防和治疗子宫颈癌提供新的手段。

    2007年05期 330-332页 [查看摘要][在线阅读][下载 347K]
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  • 经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

    董金蓉;谢飞;刘勇;郭仁;彭建新;刘红岩;

    目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。

    2007年05期 333-336页 [查看摘要][在线阅读][下载 400K]
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  • 狂犬病病毒糖蛋白富集表位基因克隆及其在原核系统中的表达

    王雷;李忠;刘晔;崔艳;卢彦欣;扈荣良;

    目的构建狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统。方法通过RT-PCR扩增CVS-24株糖蛋白两段表位富集区基因,并将其克隆至载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-G1和pET-G2,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物分别经12%SDS-PAGE和Western blot检测。结果大肠杆菌可高效表达目的基因,所表达的蛋白可被狂犬病病毒标准阳性血清所识别。经薄层扫描分析,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42%(G1)和34%(G2)。结论已成功构建了狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统,所表达的目的蛋白具有良好的免疫反应性,有可能作为检测狂犬病病毒血清抗体的候选基因。

    2007年05期 337-339页 [查看摘要][在线阅读][下载 429K]
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  • 人巨细胞病毒融合表达载体的构建及鉴定

    李猛;李春晖;徐颖鑫;邵丽军;张勇;王宣军;郭立君;

    目的构建含人巨细胞病毒(HCMV)gB680糖蛋白基因和突变的pp65蛋白基因(pp65m)的融合表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达。方法用PCR法从HCMV基因组中钓取gB680和pp65m蛋白基因,分别亚克隆入pMD18-T载体中,经酶切鉴定并测序后,构建真核表达载体pVAX1/gB680+pp65m,以ELISA法检测其在COS-7细胞中的瞬时表达。结果重组质粒含有gB680和pp65m融合基因,并能在COS-7细胞中表达。结论已成功构建了人巨细胞病毒融合表达载体,并可在真核细胞中表达。

    2007年05期 340-342+351页 [查看摘要][在线阅读][下载 437K]
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  • 特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

    何跃;谢新波;秦文珍;林学颜;湛海伦;高新;

    目的检测特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对恶性肿瘤细胞的杀伤效应。方法采用肿瘤抗原致敏的DC与CIK细胞共培养,分析其免疫表型,并用MTT染色法检测其对肿瘤细胞的杀伤力。结果所获得DC-CIK细胞的CD3异质性T细胞群,对肾透明细胞癌786-0和前列腺癌PC-3细胞的杀伤率分别为70.64%和65.65%。结论DC-CIK细胞对肾透明细胞癌786-0细胞和前列腺癌PC-3细胞具有较强的杀伤效应。

    2007年05期 343-345页 [查看摘要][在线阅读][下载 103K]
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预防制品

  • 弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠的黏膜相关淋巴细胞及其亚群的动态变化

    刘晋平;孟晓丽;殷国荣;杨亚波;刘红丽;吴静;唐旭;

    目的探讨弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠的黏膜相关淋巴细胞及其亚群的动态变化。方法取BALB/c小鼠96只,随机分为实验组和对照组,实验组以弓形虫复合黏膜疫苗20μl/只滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。滴鼻2次(间隔2周)后,分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死小鼠,分离鼻相关淋巴组织(NALT)、Peyer结(PP)和上皮内淋巴细胞(IEL),制备淋巴细胞悬液,计数并涂片。免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果实验组NALT、PP和IEL的T淋巴细胞均显著增生,PP和IEL的T淋巴细胞第2周达高峰,之后逐渐降低。与对照组相比,NALT的T淋巴细胞于第1、2、6、8、12周显著增生,PP的T淋巴细胞数于第1、2、3周显著增生,IEL于第1~4周显著增生。NALT和PP中主要以CD4+T细胞增生为主,肠IEL以CD8+T细胞增生为主。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,可诱导鼻相关淋巴组织和肠相关淋巴组织T淋巴细胞明显增生,同时诱导其向不同亚群分化。

    2007年05期 346-351页 [查看摘要][在线阅读][下载 211K]
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  • 18C型肺炎球菌荚膜多糖-TT结合物中多糖片段长度对其免疫原性的影响

    乔瑞洁;陈晓航;张勇;任克明;孔素娟;张轶;刘爱萍;沈荣;谢贵林;朱家鸿;

    目的研究18C型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合物中多糖片段的大小对其免疫原性的影响。方法采取乙酸水解多糖,Sephacryl S-300(XK-50)柱纯化多糖片段,ADH法制备结合物,免疫小鼠,检测血清的ELISA抗体滴度、亲和力以及调理吞噬能力。结果得到重复单位数分别为27、25、19、12、10、9和8的多糖片段。与TT制备的结合物在小鼠体内均能诱导产生IgG型抗体,并存在加强免疫效应,表现出T-细胞依赖型抗体免疫反应。随着链长度的缩短,血清GMT有增加的趋势,但只有8RUPn18C-TT与27RUPn18C-TT组之间差异有显著意义。当吞噬率为50%时,血清的稀释倍数分别为35.10、39.60、45.71、104.71、117.00、145.50和478.60。此趋势与抗体滴度呈正相关,但各组间亲和力差异无显著意义。结论较短多糖片段制备的结合物免疫原性高,血清GMT高,调理吞噬能力也强。

    2007年05期 352-355页 [查看摘要][在线阅读][下载 143K]
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  • BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用

    赵爱华;乔来艳;贾淑珍;寇丽杰;王国治;

    目的研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用。方法以BCG-CpG-DNA与重组HBsAg混合免疫小鼠,以铝佐剂疫苗为对照,采用放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平,ELISA法分析抗体亚类,酶联免疫斑点试验(ELIS-POT)检测CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能。结果BCG-CpG-DNA能提高抗-HBs中和抗体水平,促进抗原特异性IgG2a的产生,诱导Th1型免疫应答,与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2反应。同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用,实验组与对照组比较差异有显著意义。结论BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,有可能成为一种新型的免疫佐剂。

    2007年05期 356-358+361页 [查看摘要][在线阅读][下载 138K]
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  • 狂犬病疫苗对人外周血B淋巴细胞分泌特异性抗体的体外诱导作用

    林卫;王棣;马瑞;王玉琳;

    目的探索在体外用狂犬病疫苗诱导人外周血B淋巴细胞(PBL)分泌特异性抗体,并使B淋巴细胞保持良好增殖和分化状态的方法。方法以狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞进行体外诱导,并对诱导抗原量、诱导时间及IL-2、IL-6和胞壁酰二肽(MDP)等生物因素对诱导产生特异性抗体的影响进行检测,并观察PBL的活化与增殖状态。结果在特异抗原及其他生物因子的共同作用下,经免疫的人PBL体外抗原诱导5d后产生特异性抗体的量达到最大值。MDP、IL-2、IL-6对免疫志愿者的PBL体外特异性抗体的分泌有显著影响,但对未经免疫志愿者无明显影响。显微镜观察显示PBL生长与分化正常。结论已建立了体外诱导人外周血B淋巴细胞分泌特异性抗体的方法,并保持了B淋巴细胞良好的生长增殖和分化状态。

    2007年05期 359-361页 [查看摘要][在线阅读][下载 104K]
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治疗制品

  • 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂质量控制研究

    高凯;史新昌;丁有学;韩春梅;张翊;饶春明;王军志;

    目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。

    2007年05期 362-364+368页 [查看摘要][在线阅读][下载 126K]
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实验技术

  • 含紫杉醇PLGA缓释微球的研制及理化性质

    李艳妍;李立新;孙智辉;尹一子;

    目的研制含紫杉醇的聚乳酸和乙醇酸的共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]生物可降解高分子微球,并对其药物释放动力学进行分析。方法使用相对分子质量为20000的PLGA作为造粒对象,对不同溶剂的PLGA溶液进行喷雾化造粒,以优化出最佳造粒参数。在此条件下对含紫杉醇的PLGA溶液进行喷雾化造粒,制备紫杉醇/PLGA微球。结果形成单分散粒子的条件是较高的应用电压和较低的溶液流率,5%(wt)的PLGA溶液浓度溶于5∶1的氯仿和DMF的混合溶剂(v/v)中。在优化的喷雾参数下,得到了粒径均一、直径为300nm的单分散载紫杉醇的PLGA微粒。当紫杉醇在微球中含量较低时(2%),药物释放呈零级释放模式。较高的载药浓度(>5%)会在初期有轻微药物突释,然后呈零级释放模式。结论电喷雾化技术制备载药微粒是简单可行的新制药技术。含紫杉醇的PLGA微粒有望成为新一代抗癌药物剂型。

    2007年05期 365-368页 [查看摘要][在线阅读][下载 728K]
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  • 不同方法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗生化及免疫学特性比较

    张萍;王欣茹;侯亚莉;张新庄;杜琳;谢贵林;

    目的对两种方法制备1型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的生化及免疫学特性进行比较。方法分别采用溴化氰活化法与胺还原法制备结合物,并对其进行生化及免疫学检测。结果采用溴化氰活化法制备的结合物,较胺还原法具有较高的结合率及高分子结合物含量,免疫小鼠产生的抗体效价较胺还原法明显提高。结论采用溴化氰活化法制备1型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗优于胺还原法。

    2007年05期 369-371页 [查看摘要][在线阅读][下载 160K]
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  • 微载体培养Marc145细胞实验条件的优化

    宫飞;朱明龙;周燕;华平;邹勇;谭文松;钱永清;

    目的优化Marc145细胞在微载体上的生长条件。方法对微载体培养Marc145细胞的细胞接种密度、微载体浓度和细胞培养基等培养过程中的关键工程参数进行优化。结果以微载体细胞密度4×104个/mg、微载体浓度7mg/ml在高糖DMEM(含30mmol/L葡萄糖,6mmol/L Gln)培养基中培养,48h后每12h换液50%的培养方式效果最为理想。结论优化的培养工艺适用于病毒疫苗的生产。

    2007年05期 372-375页 [查看摘要][在线阅读][下载 130K]
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  • 纤维连接蛋白的提取及其在细胞培养中的应用

    刘颖;牟忠梅;陈喜朋;王丹;张超;李勇;马学严;

    目的从牛血清中提取纤维连接蛋白(Fibronectin,FN),并观察其在细胞培养中的作用。方法将明胶偶联于溴化氰活化的Sepharose-4B,采用亲和层析法从牛血清或粗提后的样本中提取FN,并检测其蛋白含量。用纯化的牛FN处理细胞培养板,观察细胞在板中的生长情况,并与在进口板中的生长情况进行比较。结果所提取的FN,其蛋白含量约为400μg/ml,电泳结果与FN对照品一致,均为两条主带。用其处理的细胞培养板,培养细胞的形态和密度与进口板比较无明显差异。结论用溴化氰活化的Sepharose-4B提取FN是可行的,且其在细胞培养中有良好的助黏附与贴壁作用,有助于细胞培养。

    2007年05期 376-377页 [查看摘要][在线阅读][下载 389K]
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综述

  • 甘露糖结合凝集素与疾病的关系

    刘立峰;张庶民;沈心亮;

    甘露糖结合凝集素是一种钙离子依赖性糖结合蛋白,属凝集素家族,在肝细胞内合成后分泌到血液中,其基因型和血清水平异常与多种疾病相关。本文对甘露糖结合凝集素与某些疾病的相关性作一综述。

    2007年05期 378-382页 [查看摘要][在线阅读][下载 182K]
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  • 新型狂犬病疫苗及其基因工程抗体的研究进展

    蔡昆;王慧;

    由于狂犬病动物传染源广泛存在,控制难度较大,一旦发病目前尚无法医治,所以研制狂犬病的预防制品非常重要。本文就新型狂犬病疫苗及狂犬病病毒基因工程抗体的研究进展进行比较全面的综述。

    2007年05期 383-386页 [查看摘要][在线阅读][下载 121K]
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临床观察

综述

  • DNA疫苗的安全性分析

    郝淑美;

    近年来,DNA疫苗的研究已引起了国内外学者的广泛关注,并取得了迅速发展。在这种新型疫苗进入临床研究前,必须对其安全性作出评价。本文对该疫苗接种后能否整合入宿主细胞基因组中、能否导致原癌基因激活或抑癌基因的抑制等安全隐患、DNA疫苗的标准化及接种DNA疫苗风险与效率比等作了比较全面的分析。

    2007年05期 387-390页 [查看摘要][在线阅读][下载 120K]
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  • 破伤风免疫球蛋白在破伤风治疗中的应用

    何庆;丛鲁红;

    破伤风免疫球蛋白(TIG)是治疗破伤风的重要药物之一,它能提供以IgG为主的高效抗体,中和破伤风毒素,从而发挥治疗作用。破伤风免疫球蛋白的疗效已获得国际组织机构和学者的肯定,并逐渐取代破伤风抗毒素。目前关于它的推荐治疗剂量建议很多,但尚未形成定论。本文将其最新的应用进展情况和国际上部分应用成功经验作一简述。

    2007年05期 391-392页 [查看摘要][在线阅读][下载 57K]
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实验技术