中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

  • 靶向高迁移率族蛋白A1基因RNA干扰真核表达载体的构建

    朱明光;张鑫;袁红艳;杨巍;常雅萍;

    目的构建针对人高迁移率族蛋白A1(HMGA1)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础。方法设计合成特异性针对人HMGA1基因的寡核苷酸序列,梯度退火后,与pU6mRFP载体连接,构建重组载体,转染人肝癌细胞SMMC-7721。通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光,估测转染效率,RT-PCR法检测转染细胞HMGA1mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果DNA测序证实,成功构建了特异性HMGA1siRNA真核表达载体,转染后72h,转染效率为40%左右。所构建的载体能够特异性沉默转染细胞HMGA1基因的表达。转染细胞HMGA1基因沉默后,细胞凋亡率(27·86%±2·44%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为2·82%±2·39%和2·04%±0·70%),G0-G1期细胞百分数(77·73%±1·78%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为42·19%±3·28%和39·23%±3·63%),G2-S期细胞百分数(22·27%±1·78%)明显低于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为57·81%±3·28%和60·77%±3·63%)。结论成功构建了HMGA1的RNA干扰真核表达载体。

    2007年01期 1-4页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K]
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  • shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞株P-gp表达的抑制作用

    干惠珠;张桂珍;张凤春;卜丽莎;杨绍娟;高申;郑德明;

    目的探讨靶向mdr1基因的shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞(K562/ADM)P-gp表达的抑制作用。方法合成靶向mdr1基因的短发夹shRNA表达载体,转染K562/ADM细胞。利用RT-PCR检测转染细胞中mdr1基因mRNA,Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术分别检测P-gp的表达。结果在瞬时转染pSilencerTM3·1-H1neomdr1-A和mdr1-BshRNA表达载体的K562/ADM细胞中,mdr1基因mRNA转录分别减少到39·1%(P<0·05)和30·8%(P<0·01)。Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术检测显示P-gp表达被明显而特异地抑制。结论靶向mdr1基因的shRNA表达载体能够特异而有效地抑制耐药的人红白血病细胞中的P-gp表达。

    2007年01期 5-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 264K]
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  • 重组B7-H1IgV融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

    王伟华;张英起;颜真;

    目的以B7-H1为靶点,研制肿瘤免疫治疗蛋白疫苗。方法将人B7-H1胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。Ni2+-NTA亲和层析纯化蛋白,Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H1IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术、免疫组化技术和CDC试验测定融合蛋白及其抗血清的生物学活性。结果所构建的pQE-30-TT-B7-H1IgV表达载体,能稳定表达rhB7-H1IgV蛋白,经纯化后免疫昆明小鼠,可获得高滴度抗B7-H1抗血清。经流式细胞术和免疫组化检测显示,其抗血清可与HT-29/B7-H1+及SP2/0肿瘤细胞结合,且在CDC试验中,可依赖补体杀伤HT-29/B7-H1+及SP2/0肿瘤细胞。结论rhB7-H1IgV融合蛋白不仅可引发小鼠体液免疫应答,而且其抗体还能与表达B7-H1的肿瘤细胞相结合,并介导补体依赖的体外杀伤作用。

    2007年01期 9-14页 [查看摘要][在线阅读][下载 658K]
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  • 外水相对胰岛素载药纳米颗粒胶体系统分散性的影响

    彭海生;李呼伦;吕桂香;刘明;孙博;曹京燕;乔慧;王广友;刘希君;王菁华;赵崴;

    目的探索不同外水相组成对胰岛素纳米颗粒胶体系统分散性的影响,为深入开展纳米载药颗粒研究提供依据。方法采用高速高压联合均质机,经乳化-溶剂挥发法制备不同粒径的纳米载药颗粒,再通过光学显微镜、扫描电镜、激光粒径分析仪分析颗粒在胶体系统中的分散情况。结果高速均质和高速高压均质聚乙烯醇组粒径分布(d50)分别为(5·410±0·487)μm和(0·389±0·034)μm,高速均质和高速高压均质偏磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液组粒径分布(d50)分别为(5·505±0·854)μm和(0·204±0·020)μm。联合均质结果缓冲液组粒径分布小于聚乙烯醇组,颗粒表面光滑平整;比表面积与之相反,聚乙烯醇组低于缓冲液组。结论偏磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液作为乳化-溶剂挥发法制备胰岛素纳米载药颗粒的外水相,能够获得更好的分散体系。

    2007年01期 15-18页 [查看摘要][在线阅读][下载 518K]
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  • 乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后病毒基因的变化

    吴永林;刘杰;杨会强;赵宇;汪伟;牟建超;黄玉仙;刘蓉;孙艳;俞永新;李玉华;

    目的研究乙型脑炎病毒(JEV)减毒株SA14-14-2的编码弱毒力基因变化与病毒毒力关系。方法乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在乳鼠脑内连续传代,检测各代病毒的生物学特性和病毒主要结构蛋白即E蛋白的基因序列,并与基因库中登录的JEV强毒株SA14和弱毒株的相应序列比较。结果JEVSA14-14-2在乳鼠脑内连续传代后,病毒的复制滴度增加,对小鼠的脑内毒力也有所增强,但仍低于其亲代强毒株SA14的水平。JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传1代后,病毒E蛋白的基因序列未发生改变;传第2代时,E107位点氨基酸发生了变化;第3代开始,E138位点氨基酸出现了改变。其他个别位点氨基酸也发生变化,但无规律性。乙型脑炎病毒强弱毒株间发生变化的其余7个氨基酸未再发生改变。结论JEVSA14-14-2在乳鼠脑内传代过程中,E蛋白基因E107和E138位氨基酸是决定病毒毒力的关键氨基酸。其他非结构蛋白基因也可能与毒力有关。

    2007年01期 19-21页 [查看摘要][在线阅读][下载 102K]
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  • 人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定

    胡慧中;柏佳宁;张静;何宏轩;段明星;

    目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。

    2007年01期 22-24+28页 [查看摘要][在线阅读][下载 593K]
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  • 表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

    滕红刚;姜春来;于湘晖;孔维;

    目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。

    2007年01期 25-28页 [查看摘要][在线阅读][下载 422K]
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  • 艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段的表达及纯化

    刘红升;姜泊;张清华;蒋知新;

    目的表达并纯化艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段,为制备高效防治艰难梭菌感染的疫苗和诊断抗原奠定基础。方法提取艰难梭菌染色体基因组DNA,用PCR扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达产物经金属螯合层析纯化,用SDS-PAGE进行分析。结果已成功地克隆了艰难梭菌细胞毒素B羧基末端重复区域的1848bp的基因,经双酶切、PCR和测序鉴定,插入到载体的基因与GenBank中公布的艰难梭菌VPI10463ToxinB3基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的相对分子质量为71300,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的14%,包涵体占沉淀的82·7%,纯化后可溶性蛋白浓度为0·781mg/ml。结论所构建的含艰难梭菌ToxinB3基因的pET22b(+)CDB3重组质粒能高效表达目的基因。金属螯合层析纯化重组蛋白CDB3的方法简便,特异性好。

    2007年01期 29-32页 [查看摘要][在线阅读][下载 367K]
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  • 表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用

    刘馨;张光明;李鸿钊;谢天宏;孙茂盛;

    目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒,生产后第7天和第8天,用轮状病毒SA11(1·0×106PFU)口服攻击乳鼠2次,观察出现腹泻症状的乳鼠的比例,并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体(Ad5)作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后,在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为100%(11/11);经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为30%(3/10);经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠,经轮状病毒攻击后保护率为80%(8/10)。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后,能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体,并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击,保护率达100%。

    2007年01期 33-36页 [查看摘要][在线阅读][下载 300K]
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  • 小鼠激活素受体相互作用蛋白5的基因克隆

    张红军;台桂香;杨清;杨琼;柳忠辉;

    目的克隆新的小鼠激活素受体相互作用蛋白5(ActRIP5)基因。方法应用酵母双杂交技术,筛选出与激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)相互作用蛋白的基因片段,再以此基因片段作为探针,从小鼠脑cDNA文库中钓取ActRIP5cDNA。采用哺乳动物细胞双杂交系统,进一步确定ActRIP5与ActRⅡA的相互作用。采用RT-PCR检测ActRIP5mRNA在组织中的转录。结果克隆的ActRIP5全编码基因长1839bp,编码145个氨基酸残基,与ActRⅡA具有特异结合作用。ActRIP5mR-NA在小鼠多种组织中均可检出。结论ActRIP5属于ActRIP家族新成员,可以与ActRⅡA相互作用。

    2007年01期 37-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 561K]
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  • 培养条件对HBsAg转基因人参细胞的生长及表达量的影响

    李娟;盛维瑾;刘大为;刘丹;刘晓宇;高正伦;富锐丽;高平;徐彦红;盛军;

    目的研究培养条件对HBsAg转基因人参细胞生长及HBsAg表达量的影响。方法通过单因子实验,分别考察碳源、氮源、有机成分对HBsAg转基因人参细胞生长和HBsAg表达量的影响,并通过不同组合实验,探索氮源浓度、有机成分和起始pH的最佳组合。结果在3%蔗糖、10mmol/L氮源、0·25%乳清蛋白和起始pH6·2的情况下,细胞生长量略有增加,HBsAg的表达量增加1倍。结论通过改善培养条件,可以提高HBsAg转基因人参细胞的生长速度和抗原表达量。

    2007年01期 40-42+46页 [查看摘要][在线阅读][下载 128K]
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  • 乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达

    余永恒;李清雄;王革非;邓远鹏;王贞慧;朱俊铭;

    目的利用乳糖替代IPTG,诱导重组人睫状神经营养因子(Recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor,rhC-NTF)在原核工程菌BL-TCS中可溶性表达,并选择最适的诱导表达条件。方法在不同的温度下,利用不同浓度的乳糖及0·5mmol/L的IPTG,诱导含有人CNTF基因的工程菌9h,比较菌体生长、乳糖消耗以及目标蛋白的表达规律。结果乳糖组的菌体A600值均高于IPTG组。乳糖诱导产生的rhCNTF主要以可溶形式表达,各浓度乳糖的诱导效果均能接近或超过IPTG的效果。以2%乳糖在25℃下诱导6h,可以达到比较好的诱导效果。结论乳糖可取代IPTG诱导人CNTF基因表达,并获得良好效果。

    2007年01期 43-46页 [查看摘要][在线阅读][下载 453K]
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  • Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖的抑制作用

    王艳芬;迟春萍;王志武;时成波;吉海滨;牛灵;盛军;李东复;

    目的研究Bcl-2、C-Raf及双靶点的RNA干扰质粒对人结肠癌HCT-8细胞株增殖的抑制作用。方法利用Ambion公司网上设计软件,分别以Bcl-2和C-Raf为靶标,设计合成63个核苷酸的双链RNA,构建质粒pSilencer3·1-H1/Bcl-2、pSilencer3·1-H1/C-Raf及pSilencer3·1-H1/Bcl-2/C-Raf,分别转染结肠癌细胞株HCT-8,用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,RT-PCR检测Bcl-2和C-Raf的mRNA转录。结果经MTT法检测,构建的Bcl-2和C-Raf基因及双靶点RNAi质粒3个转染组的细胞存活率均降低,双靶点质粒转染组较两个单靶点转染组细胞存活率明显降低,差异有显著意义。经RT-PCR检测,转染双靶点质粒后,HCT-8细胞中Bcl-2和C-Raf基因的表达均较对照组明显减弱。结论Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖有抑制作用。

    2007年01期 47-50页 [查看摘要][在线阅读][下载 340K]
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  • 弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的特异性抗体动态观察

    孟晓丽;殷国荣;杨亚波;唐旭;吴静;马广源;

    目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的血清IgG、粪便和鼻咽冲洗液中IgA特异性抗体动态,探讨其抗弓形虫感染作用机制。方法96只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以弓形虫复合黏膜疫苗(20μl/只)滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。分别于滴鼻2次(间隔2周)后第1、2、3、4、6、8、10和12周处死小鼠,收集血清、粪便及鼻咽冲洗液,采用ELISA法检测血清IgG以及粪便和鼻咽冲洗液中IgA抗体。结果实验组小鼠血清IgG、粪便及鼻咽冲洗液中IgA均高于对照组,血清IgG水平第3周达高峰,第14、6和8周显著高于对照组;粪便IgA抗体第2周达高峰,第2、3和4周显著高于对照组;鼻咽冲洗液中IgA第1周即达高峰,之后逐渐降低,至第12周仍显著高于对照组。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导高水平的特异性抗体,且可持续较长时间。

    2007年01期 51-53+64页 [查看摘要][在线阅读][下载 153K]
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  • 纯化胸腺肽抗白色念珠菌的效果

    迟春萍;王志武;代淑艳;杨琳;张秀霞;白春杰;王殿军;冷梅;盛军;

    目的观察纯化胸腺肽抗小鼠感染白色念珠菌的效果。方法选取昆明小鼠,建立白色念珠菌感染模型,感染浓度为0·5×106个/ml,实验分纯化胸腺肽组、胸腺肽组及空白对照组,实验组给药剂量为1·5mg/kg,对照组接种0·5ml生理盐水,感染前后10d,隔天肌肉注射,观察小鼠各项生命指标及抗感染效果。在最后一次注射后第8天,检测各组小鼠血清溶菌酶含量。结果纯化胸腺肽组各项生命指标均优于胸腺肽组及空白对照组,小鼠血清溶菌酶含量均显著高于空白对照组和胸腺肽组。结论纯化胸腺肽抗白色念珠菌感染的效果优于胸腺肽。

    2007年01期 54-55页 [查看摘要][在线阅读][下载 58K]
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  • B.abortus 544A和B.melitensis 16M多克隆抗体的制备及鉴定

    唐景峰;李晓艳;王兴龙;梅建军;刘锴;刘文森;

    目的制备高效价、高纯度的布鲁菌多克隆抗体,作为检测布鲁菌的诊断试剂。方法采用弗氏佐剂乳化抗原家兔背部皮下多点免疫,制备抗体,纯化后用SDS-PAGE进行鉴定,ELISA法检测抗体水平,紫外分光光度仪检测蛋白质含量,AlphaScreenRabbitIgGDetectionKit检测IgG含量,并计算纯度。结果SDS-PAGE结果显示多抗片段大小与预期相符,B.melitensis16M和B.abortus544A抗体效价分别为1∶25600和1∶51200,纯化后抗体蛋白含量分别为11·32和14·03mg/ml,IgG含量分别为10·45和13·12mg/ml,且纯度分别达到92·3%和93·5%。结论已获得高效价、高纯度的多克隆抗体IgG,为建立布鲁菌免疫检测方法奠定了基础。

    2007年01期 56-59页 [查看摘要][在线阅读][下载 240K]
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  • 两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子活性的影响

    陈妍;王振远;郭秀侠;田洪斌;邓英杰;

    目的考察两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的影响。方法采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,MTT法检测两种方法制备的脂质体中bFGF的活性。结果薄膜分散法和冻干重建法制备的bFGF脂质体活性分别为1·99×107和1·94×107IU/ml。与对照bFGF水溶液相比,两种脂质体制备方法均未降低bFGF活性,且包封率与粒径差异无显著意义。结论采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,对其活性均无影响。

    2007年01期 60-61页 [查看摘要][在线阅读][下载 57K]
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  • 表位疫苗的设计与优化

    石云;吴超;邹全明;

    表位疫苗是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路,其安全性好,诱发的免疫应答针对性强。要发挥表位疫苗中各表位的功能,合理的设计至关重要。本文就表位疫苗的设计及优化作一简要综述。

    2007年01期 62-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 111K]
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  • 构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略

    乔媛媛;王琰;

    构建大容量噬菌体抗体库,可实现不经免疫直接制备针对任意抗原的人源性抗体。本文综述了噬菌体抗体库技术的原理、抗体库的构建方法、不经免疫制备人源抗体的策略以及提高抗体体外亲和力的方法。

    2007年01期 65-68页 [查看摘要][在线阅读][下载 137K]
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