中国生物制品学杂志

CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

专栏——党为人民谋幸福的100年

疫苗研究

  • 4型流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化

    江征;张国梅;张哲罡;邓涛;刘京;吕传硕;乐洋;马宁;周蓉;张家友;李长贵;杨晓明;

    目的优化4型流感病毒疫苗株H1N1(IVR-215)、H3N2(NIB-121)、BV(BVR-11)、BY(BVR-1B)在稳定表达牛胰蛋白酶原的MDCK细胞(MTY6)和MDCK细胞中的增殖条件,并比较MTY6和MDCK细胞培养不同型别流感病毒的差异。方法以血凝滴度和病毒滴度[半数组织感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID_(50))]为指标,通过棋盘法对4型流感病毒疫苗株在MTY6和MDCK细胞上种毒的MOI(10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4))、胰酶终浓度(0.5、1、1.5、2μg/mL)及收毒时间(0、24、48、72、96 h)进行优化;以接毒后细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)为指标,分析两种细胞对不同型别流感病毒的敏感性。结果 H1N1、H3N2、BV和BY株病毒在MTY6细胞中培养的最适MOI分别为10~(-4)、10~(-4)、10~(-2)、10~(-2),胰酶终浓度分别为0.5、1、0.5、0.5μg/mL,收毒时间分别为96、72、48、72 h。H1N1、H3N2、BV和BY株病毒在MDCK细胞中培养的最适MOI均为10~(-4),胰酶浓度为0.5、1、0.5和1.5μg/mL,收毒时间为96、48、72和72 h。4型流感病毒疫苗株在MTY6细胞中培养比在MDCK细胞中具有更高的血凝滴度和TCID_(50)。在相同时间内,H1N1、H3N2、BY株病毒在MTY6细胞中比在MDCK细胞中能够引起更明显的CPE。结论成功优化了4型流感病毒疫苗株在MTY6细胞中的增殖条件,MTY6细胞与MDCK细胞相比,培养4型流感病毒疫苗株能够获得更高的病毒滴度,并增加病毒产量。本研究为MTY6细胞用于流感疫苗生产奠定了基础。

    2021年10期 v.34 1151-1156页 [查看摘要][在线阅读][下载 778K]
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  • 森林脑炎灭活疫苗(地鼠肾细胞)细胞工厂培养工艺的建立

    张朔;赵建;邹墅;张颖;赵东山;刘晓杰;刘玥;翟东颖;孙宏亮;

    目的应用细胞工厂代替转瓶,培养原代地鼠肾细胞制备森林脑炎灭活疫苗,建立连续培养多次收获工艺,以提高疫苗产量。方法采用40层细胞工厂培养地鼠肾细胞,确定最佳细胞培养条件。用森林脑炎病毒森"张"株感染细胞,连续收获病毒液,经超滤浓缩、灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,按照《中国药典》三部(2015版)进行相关检测。结果确定了细胞工厂制备森林脑炎灭活疫苗的工艺参数:细胞工厂最适细胞接种量为3~4对地鼠肾/层;感染病毒96 h后第1次收获,之后每48 h收获1次,可连续收获3~5次。原液中抗原含量、蛋白质含量、地鼠肾细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残余量均符合《中国药典》三部(2015版)规定。结论利用细胞工厂培养原代地鼠肾细胞制备森林脑炎灭活疫苗,获得了较高的细胞密度并收获了高毒力的病毒液,可替代转瓶培养工艺大规模制备森林脑炎灭活疫苗。

    2021年10期 v.34 1157-1160+1169页 [查看摘要][在线阅读][下载 903K]
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基础研究

  • mTOR信号通路在Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预小鼠肝纤维化进程中的作用及其机制

    王荣华;单长锋;王建英;赵子建;李芳红;

    目的探讨mTOR信号通路在Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化进程中的作用及其机制。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组,4周模型组,8周模型组及治疗组,对照组经腹腔注射玉米油;模型组及治疗组经腹腔注射含20%CCl4的玉米油溶液,5 mL/kg,每周2次,除4周模型组注射4周外,其余3组持续注射8周;治疗组在造模的同时,从第4周开始进行二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)/二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)灌胃治疗,4 g/kg,每日1次,对照组及8周模型组灌胃等剂量生理盐水。在造模完成后24 h内剖解,观察肝脏大体形态;小鼠肝组织包埋切片,HE、Masson三色及天狼星红染色评估肝组织病理变化及纤维化程度;免疫组织化学染色分析肝组织中肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化标志蛋白(α-SMA)、抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)、细胞增殖核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平;Western blot分析促纤维化蛋白(Collagen1A1、Fibronectin及α-SMA)的表达水平,同时检测m TOR信号通路中m TOR及S6蛋白的磷酸化水平。结果与8周模型组比较,治疗组小鼠肝脏形态有显著改善,但肝组织表面仍有细小颗粒;小鼠肝组织中炎症细胞浸润、肝细胞坏死及胶原沉积显著减少,其炎症及纤维化程度接近4周模型组。经免疫组织化学分析,肝组织中α-SMA蛋白表达水平显著减少(P <0.01),Bcl-2、Bcl-xL及PCNA蛋白表达水平均显著增加(P均<0.01);经Western blot分析,α-SMA、Collagen1A1、Fibronectin蛋白表达水平均显著减少(P均<0.01);m TOR及S6蛋白的磷酸化水平显著下降(P均<0.01)。结论 Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预能抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能与抑制mTOR信号通路有关。

    2021年10期 v.34 1161-1169页 [查看摘要][在线阅读][下载 1290K]
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  • 1株高滴度噬斑型三型副流感病毒野毒株的分离纯化及鉴定

    火文;关文竹;王云瑾;韩平;马超;包红;寇桂英;李雄雄;巩晗博;白慕群;

    目的从临床标本中分离1株人三型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)野毒株,并进行鉴定。方法将下呼吸道感染患儿下呼吸道分泌物通过人胚肺二倍体细胞(WI-38)传代培养分离并噬斑克隆纯化病毒。二代基因测序测定病毒全基因序列;蔗糖密度超速离心纯化病毒,电镜观察病毒大小和形态;SDS-PAGE和Western blot鉴定病毒蛋白;检测病毒在不同宿主细胞上的增殖能力和噬斑形成能力以及在体外传代的遗传稳定性和增殖稳定性。结果通过大量临床标本的传代筛选和克隆纯化,得到1株去除特定外源因子的HPIV-3野毒株HPIV3LZ17-28C19,全基因测序显示此毒株与HPIV-3基因组核苷酸序列的同源性高达99.14%;蔗糖密度超速离心纯化的毒株在电镜下可见长轴径150~300 nm的具有脂质外膜的HPIV-3病毒颗粒,含有HPIV-3的结构蛋白HN和F,在WI-38、Vero和MA104细胞中高滴度增殖,滴度在107~109copies/mL,可在Vero和MA104细胞上形成明显均一的噬斑,且在有限传代中具有遗传稳定性和增殖稳定性。结论本研究获得了1株高滴度噬斑型无特定外源因子的HPIV-3野毒株,对HPIV-3疫苗的研发以及HPIV-3感染动物模型和各种检测方法的建立具有重要意义。

    2021年10期 v.34 1170-1177+1183页 [查看摘要][在线阅读][下载 1337K]
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  • 胎盘特异蛋白8的理化性质及其分子结构分析

    刘建兵;李文龙;蔡芳芳;崔小华;郝建卿;师如意;林晓雨;李莉;

    目的对胎盘特异蛋白8(placenta-specific protein 8,PLAC8)的理化性质及其分子结构进行分析,为进一步研究PLAC8的功能及其作用机制提供新的思路和方向。方法应用ProtParam和Protscale,SignalP,TMHMM,PSORTⅡ,OPMA和Conserved Domain,NetNGlyc、YinOYang和Netphos,STRING等软件,分析PLAC8的理化性质、信号肽结构、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构和结构域、蛋白翻译后位点修饰以及预测相互作用蛋白,并构建系统进化树。结果PLAC8的相对分子质量为12 440.52,分子式为C_(524)H_(832)N_(154)O_(157)S_(22),理论等电点(PI)=7.34,不稳定指数为38.99,亲水性平均总值为0.125,脂肪指数为57.65,整体亲水区大于疏水区。PLAC8不具有信号肽和跨膜结构域;定位于细胞外基质(44.4%)、细胞质(33.3%)、液泡(11.1%)和细胞核(11.1%);二级结构主要由α-螺旋(47%)组成;保守结构域由77个氨基酸残基构成;有5个O-糖基化位点和4个磷酸化位点;互作蛋白主要包括中性粒细胞弹性蛋白酶(elastase,neutrophil expressed,ELANE;score:0.913)、组蛋白酶G(cathepsin G,CTSG;score:0.913)、组蛋白酶(cathepsin G,CTSC;score:0.910)等10个蛋白。人PLAC8的蛋白序列与黑猩猩相似度最高,与家兔相似度最低。结论 PLAC8是一种碱性蛋白,主要定位于细胞外基质,且具有多个糖基化和磷酸化修饰位点,能够与多个蛋白形成互作网络;人PLAC8的蛋白序列与黑猩猩相似度最高。本研究将为进一步探讨PLAC8在生命活动中的功能及其作用机制提供了新的思路。

    2021年10期 v.34 1178-1183页 [查看摘要][在线阅读][下载 1175K]
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  • 基于双相动力学分析靶向药物联合应用对肝癌细胞SNU-387增殖的影响及其作用机制

    刘畅;裴晋红;穆秀丽;于保锋;

    目的基于双相动力学分析靶向药物联合应用对肝癌细胞SNU-387增殖的影响,并探讨其作用机制。方法 MTT法检测肝癌细胞SNU-387对11种酪氨酸激酶抑制剂(AZD6244、AZD6482、BGJ-398、BMS-754807、bosutinib、crizotinib、dasatinib、gefitinib、imatinib、sunitinib、HG6-64-1)的敏感性;分别采用单靶点动力学公式和双相动力学公式分析肝癌细胞SNU-387与BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1的相互作用,计算拟合曲线的残差平方和(the sums of squared residues,SSR);Western blot法检测BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1对SNU-387细胞关键信号通路的影响;MTT法检测BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1联合应用对SNU-387细胞增殖的影响,计算减量指数(dose reduction index,DRI)。结果 SNU-387细胞对BMS-754807、HG6-64-1及1μmol/L的dasatinib比较敏感。与单靶点动力学公式比较,双相动力学公式可更好地分析肝癌细胞SNU-387与酪氨酸激酶抑制剂的相互作用。BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1联合应用时F1相靶点不重合,对SNU-387细胞增殖具有显著协同抑制作用。结论 BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1通过同时抑制不同靶点协同抑制肝癌细胞SNU-387的增殖,三者联合应用有望成为一种治疗肝癌的潜在药物组合。

    2021年10期 v.34 1184-1190页 [查看摘要][在线阅读][下载 1193K]
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  • 磷脂酰肌醇蛋白聚糖1表达对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及周期的影响

    崔营营;李诗扬;赵雅男;迪力娜尔·艾尔肯;刘倩倩;陈玉丙;

    目的探讨沉默磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican,GPC)1表达对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及周期的影响。方法从针对GPC1基因的4组含不同shRNA序列的干扰载体中筛选沉默效率最高的一组,将转染该组干扰载体的A549细胞作为GPC1沉默组(shGPC1),另设空白对照组(NC,未转染)及阴性对照组(shNC,转染无意义shRNA序列质粒),采用Real time PCR和Western blot法分别检测转染后各组A549细胞中GPC1 mRNA及蛋白的表达水平,CCK8法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡及周期变化。结果 shGPC1组A549细胞中GPC1 mRNA及蛋白的表达水平比NC组和shNC组均明显降低(P <0.001)。与NC组及shNC组比较,shGPC1组A549细胞的生长明显受到抑制(P <0.001),细胞抑制率分别可达40.32%和39.82%;细胞凋亡率分别增加9.9%和9.06%(P <0.001);细胞G_2/M期比例分别增加16.01%和15.07%(P <0.001)。结论沉默A549细胞中GPC1的表达可抑制细胞增殖,加速细胞凋亡,引起细胞发生G_2/M期阻滞。本研究为以GPC1作为参考靶点开发非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)新的靶向药物提供了参考,也为开发放疗联合靶向GPC1治疗NSCLC的新型治疗方案提供了思路。

    2021年10期 v.34 1191-1196页 [查看摘要][在线阅读][下载 1239K]
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  • 2015—2019年辽宁省麻疹病毒基因型及流行株血凝素基因特征分析

    郝爽;王文思;方兴;王艳;

    目的对辽宁省2015—2019年麻疹病毒基因型及流行株血凝素(hemagglutinin,H)基因特征进行分析,为实现消除麻疹目标提供科学依据。方法对2015—2019年获得的53株麻疹病毒(或原始标本),采用RT-PCR法扩增N基因羧基末端450个核苷酸片段,进行基因定型,并对流行的麻疹毒株H基因全长1 854个片段进行核苷酸和氨基酸序列变异分析。结果 2015—2019年辽宁省共检测到H1a、A和D8 3个基因型病毒,分离到30株麻疹病毒,其中29株为H1a基因亚型,并分为2个分支:Cluster1和Cluster2。H蛋白与疫苗株相比,遗传距离有逐年增大趋势,且在个别氨基酸功能位点上发生了变异,Cluster1所有毒株均在第397位发生了氨基酸的替换,由脯氨酸(Pro P)突变成亮氨酸(Leu L)。结论辽宁省2015—2019年流行的麻疹病毒以H1a基因型为主,且存在不同年份之间麻疹毒株的持续循环传播。H1a基因型麻疹毒株大部分重要的氨基酸功能位点均保持稳定,我国使用的麻疹疫苗对目前流行的麻疹毒株仍具有较好的保护效果。

    2021年10期 v.34 1197-1201页 [查看摘要][在线阅读][下载 1248K]
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治疗制剂

  • 甘珀酸对大鼠切口痛的影响及其作用机制

    东淑珍;石翊飒;师永倩;金平;

    目的探讨鞘内注射甘珀酸(carbenoxolone,CBX)对大鼠趾部切口痛的影响及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组、CBX组(0.6μg/10μL)、抑制剂组(1.25μg/10μL)。生理盐水组、CBX组、抑制剂组大鼠于术前30 min经鞘内分别注射生理盐水、CBX、CBX抑制剂10 panx,均10μL/只,模型组不给药;采用经典Brennan法对大鼠进行趾部切口痛模型操作,对照组不给药不进行手术处理。于术前30 min及术后2、4、6、24 h测定各组大鼠的机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)。于术后2、4、6、24 h,Western blot法测定各组大鼠脊髓腰膨大中缝隙连接蛋白1(pannexin 1,PX1)的表达水平。于术后2 h,免疫荧光法检测对照组、模型组、CBX组、抑制剂组大鼠脊髓腰膨大的PX1及与脊髓星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的共表达情况。结果各组大鼠术前MWT及TWL差异均无统计学意义(P> 0.05)。与对照组比较,模型组和生理盐水组术后2、4、6 h的MWT明显降低(P <0.001);各时间点的TWL明显降低(P <0.001),PX1的表达水平明显升高(P <0.05)。与模型组比较,生理盐水组各时间点MWT、TWL、PX1差异均无统计学意义(P> 0.05);CBX组及抑制剂组术后2、4 h的MWT均明显升高(P <0.001),2、4、6 h的TWL明显升高(P <0.001);CBX组2、4、24 h的PX1表达水平明显降低(P <0.05),抑制剂组2、4、6、24 h的PX1表达量明显降低(P <0.05)。与CBX组比较,抑制剂组各时间点的MWT差异无统计学意义(P>0.05),术后2和24 h的TWL明显升高(P <0.05);术后2、6 h的PX1蛋白表达水平明显降低(P <0.05),术后4 h明显升高(P <0.05)。模型组的PX1和GFAP共表达最明显,CBX组的共表达有所减少,抑制剂组减少最显著。结论 CBX可缓解大鼠趾部切口痛,可能是通过抑制PX1的表达及星形胶质细胞的活化而发挥作用的。

    2021年10期 v.34 1202-1206+1211页 [查看摘要][在线阅读][下载 1345K]
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诊断制剂

  • 人β2微球蛋白在不同原核表达载体中的表达及活性比较

    陈宴霞;黄曼娜;邱立明;刘曼;蔺庆辉;

    目的在不同原核表达载体中表达人β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2MG),并比较两种蛋白的活性。方法将人β2MG基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)-β2MG和pET-32a(+)-β2MG,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。获得的两种β2MG融合蛋白菌液经离心、超声破碎处理后,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析,利用Ni柱亲和层析法纯化目的蛋白,间接ELISA法检测两种融合蛋白的免疫学活性。结果不同表达载体所表达的β2MG溶解性不同,pET-28a(+)-β2MG于37℃诱导表达的His-β2MG以包涵体形式表达,pET-32a(+)-β2MG于25℃诱导表达的Trx-His-β2MG以可溶性蛋白形式表达。纯化的两种融合蛋白纯度均可达95%以上,Trx-His-β2MG的免疫学活性显著高于His-β2MG,且优于对标抗原。结论人β2MG在不同原核表达载体中的表达位置和活性均不同,可溶性表达的Trx-His-β2MG具有较高的免疫学活性,应用价值较大,为免疫诊断试剂的开发奠定了基础。

    2021年10期 v.34 1207-1211页 [查看摘要][在线阅读][下载 1199K]
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  • 人类白细胞抗原组织配型基因分型国家参考品的研制

    胡泽斌;高飞;刘湘;兰更欣;李丽莉;黄杰;

    目的研制人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)组织配型基因分型国家参考品。方法采集45份志愿者的新鲜外周血样本,经EB病毒转化,培养建立永生化细胞系。提取细胞系基因组DNA,分光光度计测定A260/280;细胞系基因组DNA反复冻融3次后,进行琼脂糖凝胶电泳分析;采用HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLADQB1位点基因高分辨分型试剂盒(测序法)进行全外显子基因分型,并与建系前外周血基因组DNA的分型信息进行比较。将检测结果符合要求的样本组成国家参考品,采用高分辨基因测序分型法(sequence-based typing,PCR-SBT)进行稳定性和均匀性验证。结果共获得38株永生化HLA细胞系,基因组DNA的A260/280在1.80~2.15之间;琼脂糖凝胶电泳分析均未见拖带或弥散带,条带完整清晰;分型结果与建系前外周血基因组DNA的分型信息一致。以上述38份基因组DNA样本制备的HLA组织配型基因分型国家参考品,具有良好的均匀性和稳定性。结论成功建立了HLA组织配型基因分型国家参考品,可用于基因分型类检测试剂盒的质量评价。

    2021年10期 v.34 1212-1215页 [查看摘要][在线阅读][下载 1154K]
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临床研究

  • EV71灭活疫苗适龄接种儿童CVA6血清中和抗体变化分析

    曾洁媛;殷琼洲;王雷;李家洪;张莹;王丽春;李琦涵;杭连菊;车艳春;

    目的观察肠道病毒71型(entervirus type 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)适龄接种儿童柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)血清中和抗体变化情况。方法收集EV71灭活疫苗接种儿童的免疫前及免疫后血清,采用微量中和试验检测抗EV71和CVA6中和抗体滴度。结果无手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)疾病史及EV71灭活疫苗接种史的6~71月龄儿童的血清抗EV71及抗CVA6中和抗体阳性率分别为27.93%和33.91%,共同阳性率为15.32%;两种抗体阳性率总体呈随月龄增加而逐渐升高的趋势(EV71:χ~2=4.436,P <0.001;CVA6:χ~2=2.083,P=0.037)。完成EV71灭活疫苗2剂免疫后,抗EV71及抗CVA6中和抗体共同阳性率由15.32%升至32.74%,4个年龄组的抗体共同阳性率也分别由0.00%、8.33%、8.33%和31.11%上升至23.81%、28.00%、13.04%和50.00%;抗EV71中和抗体阳性率(27.93%vs. 98.23%;χ~2=119.257,P <0.001)和几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)(7.01 vs. 46.52;χ~2=78.730,P <0.001)均较免疫前明显上升;而抗CVA6中和抗体阳性率在免疫前后均为33.91%(χ~2=0.000,P> 0.05),GMT在免疫前后差异也无统计学意义(3.09 vs. 4.10;χ~2=0.883,P=0.348)。结论 EV71灭活疫苗适龄接种人群EV71及CVA6的隐性感染率和共同隐性感染率较高。接种EV71灭活疫苗对适龄儿童的抗CVA6中和抗体水平无影响,表明EV71和CVA6之间无中和交叉反应。

    2021年10期 v.34 1216-1221+1226页 [查看摘要][在线阅读][下载 1361K]
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  • 2018—2020年陕西省Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗疑似预防接种异常反应监测分析

    刘晓宇;马锐;胡伟军;高宇畅;侯绪光;王辉;张少白;

    目的分析2018—2020年陕西省Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗[inactivated poliomyelitis vaccine prepared from Sabin strain(Vero cells),sIPV]疑似预防接种异常反应(adverse event following immunization,AEFI)的发生情况。方法通过AEFI监测信息管理系统收集陕西省2018年1月1日—2020年5月6日sIPV监测数据,采用描述性流行病学方法进行分析。结果陕西省2018年1月1日—2020年5月6日共报告sIPV的AEFI病例141例,报告发生率为34.24/10万,其中一般反应报告发生率为32.29/10万,异常反应报告发生率为1.46/10万。一般反应以发热(占比42.68%)、婴儿哭闹(占比18.41%)、疫苗接种部位肿胀(占比12.97%)为主,异常反应以过敏性皮疹(占比42.86%)为主。无严重AEFI病例报告,AEFI病例总体转归情况良好。结论 sIPV具有良好的安全性,AEFI以一般反应为主。

    2021年10期 v.34 1222-1226页 [查看摘要][在线阅读][下载 1231K]
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技术方法

  • 重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

    吴清胜;吴相英;姚春萍;李媛媛;

    目的建立用于重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度检测的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法利用Bac-to-Bac技术构建重组穿梭质粒(rBacmid-H5),以其为模板,梯度PCR扩增H5基因,优化退火温度和引物浓度,建立qPCR检测方法,对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR方法对H5杆状病毒连续传代4次以及连续培养0~6 d的样品进行检测,并与免疫荧光法进行比较。结果在退火温度55℃,1μL 10 mmol/L引物条件下,建立了qPCR法,该方法检测H5基因,专属性良好;模板浓度在1.15×10~3~4.25×10~9copies/μL之间,线性关系良好,R~2=0.999;6次重复检测重组H5杆状病毒培养3 d样品,RSD为1.01%,重复性较好。H5病毒连续传代4次,病毒滴度保持相对稳定,培养0~6 d病毒滴度在第3天达到较高值,且检测值均高于免疫荧光法。结论建立了qPCR法进行H5N1流感血凝素重组杆状病毒滴度的特异性检测。

    2021年10期 v.34 1227-1231页 [查看摘要][在线阅读][下载 1257K]
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  • 牛多瘤病毒PCR检测方法的建立及验证

    牛步青;胡术然;高有;张海浩;陈蕾西;常亚军;易力;姚宇峰;任芳芳;

    目的建立牛多瘤病毒(bovine polyomavirus,BPyV)的PCR检测方法,并进行验证。方法根据NCBI中登录的BPyV主要衣壳蛋白基因序列(BPyV_gp4 VP1,NC_001442.1)设计2对引物:9PF、9PR和3PF、3PR。合成BPyV主要衣壳蛋白基因序列,并与pUC57质粒构建重组质粒。以重组质粒为模板进行PCR扩增,优化退火温度。验证方法的灵敏度及特异性,并使用该方法对Vero、MDBK、KMB17和BT细胞的培养上清液进行检测。结果建立的PCR法可以BPyV-frag重组质粒为模板扩增出特异性条带,最适退火温度为60℃。2对引物的灵敏度均达2 fg/μL(558 copies/μL),引物对9PF、9PR的灵敏度略高于3PF、3PR;引物3PF、3PR和9PF、9PR以高浓度的BPV DNA(101.6 ng/μL)和BAV DNA(97.5 ng/μL)为模板时,均无扩增条带,微量BPyV-frag重组质粒产生扩增条带。Vero、MDBK、KMB17和BT细胞培养上清液中均未检出BPyV。结论成功建立了BPyV的PCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性强,可用于检测细胞培养上清液中的BPyV。

    2021年10期 v.34 1232-1235+1242页 [查看摘要][在线阅读][下载 1302K]
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  • 轮状病毒微滴数字PCR检测方法的建立、优化、验证及应用

    尚丛珊;孟婷婷;侯亚妮;李元;刘利兵;

    目的建立轮状病毒(rotavirus,RV)微滴数字PCR(RT-ddPCR)检测方法,并进行优化及验证,同时与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法进行比较。方法根据NSP5基因保守序列特征,筛选引物和探针,建立RV的RT-ddPCR检测方法,并优化退火温度(55.1、56.0、57.2、58.1、58.9、59.9、61.0、62.1、63.2、64.1、64.9℃)、引物浓度(40、60、100、120 nmol/L)及探针浓度(60、70、80、90、100 nmol/L),同时验证方法的特异性、线性范围、精密性及灵敏性。采用RT-ddPCR和RT-qPCR法同时检测150份腹泻患儿的粪便样本,计算两者符合率。结果确定RT-ddPCR法最适退火温度为61.0℃,最适引物及探针浓度分别为100和60 nmol/L。优化的RT-ddPCR法检测RV有阳性微滴生成,其他病毒无阳性液滴生成,且RV阳性与阴性微滴簇显著分开,两者之间弥散微滴较少;RNA核酸标准物质在4.95~49 000 copies/μL范围内,与检测值呈良好的线性关系,线性方程为y=1.100 0 x-44.257 0,R2为1.000 0;RNA核酸标准物质理论拷贝数为24.5~49 000 copies/μL时,精密性检测的RSD为1.75%~5.24%;最低检测稀释倍数为5×107,即拷贝数为2.45 copies/μL。RT-ddPCR和RT-qPCR法检测150份腹泻患儿的粪便样本,98份为阳性,52份为阴性,两者符合率为100%。结论成功建立了RV的RT-ddPCR检测方法,该方法具有良好的特异性及精密性,可用于RV的临床快速检测。

    2021年10期 v.34 1236-1242页 [查看摘要][在线阅读][下载 1462K]
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  • 液相色谱质谱对重组人生长激素-Fc(CHO细胞)二硫键连接的确认

    朱秋媚;王宇;刘涵;富瑞丽;刘莹;刘景会;顾建阳;

    目的利用液相色谱质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc二硫键连接进行确认。方法液相色谱条件为色谱柱:CSHC18(2.1 mm×100 mm,130?,1.7μm);流动相A:100%水(含0.1%甲酸);流动相B:100%乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.3 mL/min;柱温:65℃;上样量:5μL,梯度洗脱。质谱条件:MSE采集模式;毛细管电压:2 500 V;Cone电压:40 V;去溶剂气体温度:350℃;源温:120℃;去溶剂气体流速:600 L/h;一级质谱扫描范围:100~2 000 m/z。样品用8 mol/L盐酸胍于50℃变性30 min、1 mol/L碘乙酰胺室温烷基化0.5 h,离心置换成50 mmol/L NH4CO3(pH 8.0)缓冲液后,用胰酶(w/w,1∶15)37℃酶解4 h,利用LC-MS对酶解的肽段进行采集和分析。结果确认rhGH-Fc二硫键连接为Cys53-Cys165,Cys182-Cys189,1∶Cys210-2∶Cys210,1∶Cys213-2∶Cys213,Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,与理论连接一致。结论建立了稳定的LC-MS方法分析rhGH-Fc的二硫键连接,可用于rhGH-Fc的常规分析。

    2021年10期 v.34 1243-1247+1252页 [查看摘要][在线阅读][下载 1524K]
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综述

  • 人二倍体细胞在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展

    石磊泰;李玉华;

    狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的以中枢神经系统症状为主的一种动物源性传染病,病死率几乎100%。疫苗是预防狂犬病最主要的手段。目前,人用狂犬病疫苗生产使用的细胞基质包括鼠脑、猴肾细胞、原代地鼠肾细胞和人二倍体细胞(human diploid cell,HDC),其中HDC已成为WHO认可的更安全的疫苗生产用细胞,该细胞无致癌性、无外源因子污染、且细胞性状比较稳定,已广泛应用于人用疫苗的研发与生产。本文就HDC在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展作一综述。

    2021年10期 v.34 1248-1252页 [查看摘要][在线阅读][下载 1266K]
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  • 铜绿假单胞菌疫苗的研究进展

    杨敬鹏;马翠翠;王震玲;

    铜绿假单胞菌是院内感染常见的条件致病菌之一,其感染严重威胁人类公共健康。铜绿假单胞菌复杂的耐药机制使得临床抗生素治疗变得非常困难,需要寻找新的治疗方法。近年来,组分苗[如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)、鞭毛等]、亚单位疫苗[如外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)]、全菌体灭活疫苗、减毒活疫苗等铜绿假单胞菌疫苗已开展研究。有多个疫苗产品进入临床研究阶段,截至目前为止,尚无批准的铜绿假单胞菌疫苗上市。本文对铜绿假单胞菌疫苗的研究进展作一综述,并对疫苗研发中出现的问题进行讨论。

    2021年10期 v.34 1253-1259页 [查看摘要][在线阅读][下载 1406K]
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  • 卡介苗生产工艺、质量、使用现状及新型结核病疫苗的发展趋势

    蒋加庆;景辉;李秀玲;

    卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)目前仍是WHO推荐预防结核病(tuberculosis,TB)的唯一疫苗,对儿童中的结核性脑膜炎及播散性TB具有较好的预防作用,可降低重症TB的风险。虽然新生儿接种BCG效果肯定,但对多数成人肺部疾病的预防作用不一,防治效果差异显著。本文对TB及BCG免疫现状,BCG菌种特性、生产工艺、质量标准、质量风险、接种和接种后异常反应,以及发展现状和发展趋势等方面作一综述,并对BCG的发展及改进提出建议,对BCG的非特异性保护作用及新型TB疫苗的研究进展进行展望。

    2021年10期 v.34 1260-1268页 [查看摘要][在线阅读][下载 1460K]
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  • 白细胞介素-33在肿瘤免疫中的作用

    陈永俊;马雁冰;

    白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)组成性表达于内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞等非造血细胞上,在基质细胞上可诱导性表达,其在病毒感染、自身免疫病、伤口愈合和纤维化中发挥重要作用。IL-33作为调节机体免疫的重要细胞因子之一,除对Th1和Th2型免疫具有激活和活性维持作用外,还能募集激活免疫抑制性细胞,反向调节机体免疫,保持免疫系统的稳态。IL-33在肿瘤免疫中具有双重作用,可能与肿瘤的组织起源、IL-33的剂量、肿瘤微环境、IL-33的来源等有关,IL-33在不同肿瘤免疫中的作用机制不同。本文就IL-33的功能及其在肿瘤免疫中的作用进行综述。

    2021年10期 v.34 1269-1272页 [查看摘要][在线阅读][下载 1302K]
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